双酚A(BPA)是一种被优先控制的工业污染物^〔1〕。其性质稳定，难降解，易于流失到江河湖泊等广泛的水体中，对水生生物的生殖、神经、免疫及内分泌系统造成严重的危害，导致其发生某些病变、癌变和畸变^〔2〕。若BPA经食物链在生物体内富集，最终将影响人类的健康，因此快速有效去除水中BPA是全世界研究关注的热点问题。目前，去除BPA常用的方法有物理吸附法^〔3〕、化学氧化法^〔4〕和生物转化法^〔5〕等。相对而言，酶催化氧化降解酚类污染物因具有效率高、速度快、条件温和、绿色安全等特点而具有良好的前景。

过氧化物酶(POD)广泛存在于动植物和微生物体内，是一类可催化氧化有害有机污染物的生物酶，在环境修复领域具有巨大的潜在应用价值。其作用原理是催化过氧化物(一般为H₂O₂)，产生羟基自由基，氧化降解酚类物质，生成不溶性沉聚物，进而达到分离去除的目的。国内外主要用于降解酚类研究的POD有辣根POD、大豆POD和木质素POD等^〔6〕。这些酶因含量低，如果直接从原料制备而使用，其实用成本较高，所以应选择廉价原料制备酶活力较高的POD，用于催化氧化降解酚类污染物。

POD在生物界分布广泛，而酶蛋白通常是水溶性的，如果能从生物原料加工的废液中收集酶蛋白，将是一条低成本获取酶催化剂的途径。马铃薯通常被大量用作加工淀粉的原料，生产马铃薯淀粉时有大量的废水排出，其中含有大量蛋白质，包含POD^〔7〕。有研究发现，马铃薯POD(PPOD)酶活较高，稳定性较好^〔8〕。本试验旨在实验室模拟制备马铃薯淀粉废水，并从中分离出PPOD，并催化H₂O₂氧化降解目标酚类污染物BPA，研究PPOD催化氧化BPA的效果，以期为水环境的修复提供一种快速有效的方法。

新鲜马铃薯袁购于天津市侯台农贸市场。BPA、愈创木酚、盐酸、天津市北方天医化学试剂厂；4-氨基安替比林、磷酸氢二钠、聚乙二醇6000(PEG 6000)、H₂O₂(30%)，天津市光复精细化工研究所；铁氰化钾、磷酸二氢钠、氢氧化钠、(NH₄)₂SO₄，天津市风船化学试剂科技有限公司；考马斯亮蓝，南京建成生物工程研究所，以上试剂均为分析纯。

主要仪器与设备：T6型紫外分光光度仪，北京普析通用仪器公司；HI98190型pH计，哈纳水环境工程(上海)有限公司；Avanti JXN-26型超速离心机，美国贝克曼库尔特公司；DJ13E-Q1型豆浆机，九阳股份有限公司；GOLD-SIM型冷冻干燥机，美国金西蒙国际公司；IKA RET型磁力搅拌器，上海右一仪器有限公司。

PPOD活力的测定：在50 mL 0.1 mol/L的磷酸缓冲液(pH为6.0)中，加入28 μL愈创木酚，于40 ℃加热搅拌，至愈创木酚全溶，溶液冷至室温，加入19 μL H₂O₂(30%)，混合均匀，作反应液，于4 ℃保存。在5 mL比色皿中测定酶活力〔1个酶活力(U)单位为吸光度值每分钟增加0.01所需要的酶量〕，参照样为3 mL反应液和100 μL磷酸缓冲液的混合液；测定样为3 mL反应液和100 μL酶液的混合液。测定波长为470 nm，每隔30 s读取吸光度1次。

蛋白含量的测定：采用Bradford法测样品蛋白质含量，以牛血清白蛋白为标准品。

新鲜马铃薯去皮洗净后切成小块，放入豆浆机中，按照质量体积比为1:1加入0.05 mol/L pH为7.2的磷酸缓冲液，匀浆。匀浆液用多层纱布过滤，清液于4 ℃放置4 h。10 000 r/min、4 ℃条件下离心30 min，用上清液模拟马铃薯淀粉加工废水，为粗酶液。

(1) 将不同浓度的PEG 6000与10 mL粗酶液等体积充分混合，于4 ℃静置20 min后测PPOD活力，与参照样，即0.05 mol/L pH为7.2的磷酸缓冲液与粗酶液的混合液相比较，得到相对酶活力。

(2) 将不同浓度的(NH₄)₂SO₄溶液与10 mL粗酶液等体积充分混合，于4 ℃静置20 min后测PPOD活力，与上述参照样相比较，得到相对酶活力。

(3) 在9组100 mL粗酶液中分别加入(NH₄)₂SO₄和PEG 6000，前者最终质量分数分别为10%、12%、15%，后者最终质量分数分别为12%、15%、20%。室温下，以350 r/min搅拌10 min，转至离心管中，以6 000 r/min离心5 min，测PEG上相、盐下相的酶活力，与粗酶液酶活力比较，得到相对酶活力，并计算双相体积比(R)，R=V_下相/V_上相、酶活力分配系数(K)，K=U_下相/U_上相、酶活力回收率(Y)，Y=RK/(1+RK)。

(4) 调节双水相体系〔12%(NH₄)₂SO₄和15%PEG 6000〕的pH，测算相对酶活力。

室温下，在1 L粗酶液中，分次加入PEG 6000和(NH₄)₂SO₄，以350 r/min搅拌，使其终质量分数分别为15%和12%。混合液转移至分液漏斗，静置1 h，收集下相液体。收集液装入透析袋(截留相对分子质量为8 000~14 000)，浸入1 L蒸馏水中，每隔4 h更换1次蒸馏水，于4 ℃透析24 h至无盐(用1%氯化钡溶液检测至无白色沉淀生成)。于4 ℃、4 000 r/min的条件下离心10 min，收集上清液。上清液放入平皿，于-80 ℃冷冻至固体，再于-40 ℃真空干燥8 h，得到固体酶粉，待降解用。

制作标准曲线：在4 mL离心管中加入不同体积的0.1 mol/L BPA溶液、200 μL 83.4 mmol/L铁氰化钾溶液、200 μL 20.8 mmol/L 4-氨基安替比林溶液，并用0.1 mol/L pH为6的磷酸缓冲液调整反应体系体积为2 mL，反应10 min，取样1 mL，在波长为510 nm处测吸光度，绘制吸光度-浓度标准曲线，以此计算降解体系中BPA的残余量。

BPA降解率：降解反应后的样品在4 ℃、4 000 r/min条件下离心3 min，取上清液50 μL于4 mL离心管中，并加入1 550 μL 0.1 mol/L pH为6的磷酸缓冲液、200 μL 83.4 mmol/L铁氰化钾溶液、200 μL 20.8 mmol/L 4-氨基安替比林溶液，调整反应体系体积为2 mL，室温静置10 min，颜色稳定无变化，取样1 mL，在波长为510 nm处测吸光度。根据标准曲线，可得t时刻降解体系中BPA的浓度c_t，BPA初始浓度为c₀，降解率(η)按照η=〔(c₀-c_t)/c₀〕×100%计算。

酶促降解反应：设置降解体系为1 mL，以BPA为降解的目标污染物，H₂O₂为氧化剂，制备的PPOD固体酶粉为催化剂，0.1 mol/L磷酸缓冲溶液为溶剂。在分别改变PPOD活力、H₂O₂浓度、pH、温度和BPA浓度中1个条件而其他条件恒定不变的情况下，静置催化降解反应，反应后，样品离心，取样分析，计算BPA的降解率。

(1) 在H₂O₂为1.0 mmol/L，pH为6，温度为25 ℃，BPA初始浓度为1.0 mmol/L的条件下，PPOD酶活力分别为0、50、100、200、400 U/mL时，降解一定时间后，样品离心，取样分析，计算BPA降解率；(2)在PPOD为200 U/mL，温度为25 ℃，H₂O₂为1.0 mmol/L，BPA初始浓度为1.0 mmol/L的条件下，pH分别为3、4、5、6、7、8、9时，降解10 min，分析计算BPA降解率；(3)在PPOD为200 U/mL，pH为6，H₂O₂为1.0 mmol/L，BPA初始浓度为1.0 mmol/L的条件下，温度分别为10、20、30、40、50 ℃时，降解10 min，分析计算BPA降解率；(4)在PPOD为200 U/mL，pH为6，室温，BPA初始浓度为1.0 mmol/L的条件下，H₂O₂分别为0.5、1.0、1.2、1.5、2.0 mmol/L时，降解10 min，分析计算BPA降解率；(5)在PPOD为200 U/mL，pH为6，室温，H₂O₂为1.0 mmol/L的条件下，BPA初始浓度分别为0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mmol/L时，降解10 min，分析计算BPA降解率。

PPOD粗酶液的蛋白质量浓度为1 g/L，PPOD酶活力为450 U/mL。可选用双水相萃取法从粗酶液中进一步分离纯化PPOD，相对于等电点沉淀、有机溶剂沉淀和盐析法等，双水相萃取收集酶蛋白因具有条件温和、蛋白不易失活、操作简单、节能省时等特点而较适合工业生产^〔9〕。另外，从植物中提取酶蛋白时，通常有色素存在，且植物匀浆常会褐变，会对后续纯化实验造成影响，而在双水相萃取时，色素和褐变物等较多分散于上相PEG层，便于与蛋白分离^〔10〕。

为构建用于萃取PPOD较好的双水相条件，首先分别研究了单水相中PEG 6000和(NH₄)₂SO₄质量分数对PPOD活力的影响，结果见图 1。

由图 1可知，随着PEG 6000质量分数的增加，PPOD相对酶活力呈现先升后降的趋势，PEG 6000质量分数为15%时，酶活力最高，PEG 6000质量分数超过15%时，酶活力快速下降，PEG 6000质量分数为10%~15%时，酶活力相对较高；(NH₄)₂SO₄质量分数在5%~20%范围内，PPOD相对酶活力均在90%以上，当(NH₄)₂SO₄质量分数超过20%时，酶活力快速下降，(NH₄)₂SO₄质量分数为12%~20%时，相对酶活力较高。进而，由不同质量分数的PEG 6000、(NH₄)₂SO₄组合构建9个双水相萃取体系，其PPOD酶活力回收率及酶活力分配系数见图 2。

由图 2可知，PPOD酶活力分配系数和回收率在PEG 6000质量分数为15%时最大，且PEG 6000质量分数相同时，(NH₄)₂SO₄质量分数为12%时最佳，因此，选择15%PEG 6000-12%(NH₄)₂SO₄双水相体系对PPOD萃取的效果较好，其酶活力回收率为96.4%、酶活力分配系数为26.7，萃取效果优于从白萝卜中提取的POD^〔11〕。

溶液pH一般会影响蛋白质的解离程度，改变其带电性，从而影响其在双水相中的分配。在pH为5~9的双水相体系中分别萃取PPOD，结果表明，pH对其酶活力分配系数影响不大，在pH为6时酶活力分配系数相对最大。说明，PPOD在较宽的pH范围内活性稳定，具有植物POD对pH稳定的特点^〔12〕。对于马铃薯淀粉加工废水，可在pH为6的15%PEG 6000-12%(NH₄)₂SO₄双水相体系中萃取分离，再经过盐析和冻干得固体酶粉。

参考相关研究^〔6〕，PPOD催化H₂O₂降解BPA的机理可理解为3步循化反应，首先是基态酶活性中心铁卟啉中心的铁结合过氧化氢形成高活性的游离基正离子化合物Ⅰ，随后引发酚类物质发生2步游离基反应，酚类物质被快速降解，酶返回到基态，反应机理见图 3。

BPA浓度在0.01~0.20 mmol/L范围内，与铁氰化钾、4-氨基安替比林快速反应，生成的橙红色吲哚酚安替比林染料在510 nm有特征吸收，在这个波长下，反应后溶液的吸光度A_{510 nm}与BPA浓度c呈线性关系，用Origin 8.5对坐标点(A_{510 nm}，c)进行线性拟合得到BPA标准曲线，结果见图 4。

在酶促H₂O₂氧化降解BPA的体系中，按照1.7部分的设计，改变PPOD浓度，随着时间的延长，考察PPOD酶活力和反应时间对BPA降解效果的影响，结果见图 5。

由图 5可知，随着PPOD活力增加，BPA降解率随之升高，在10 min时，含200 U/mL和400 U/mL PPOD的体系中，BPA降解率较高，分别为91.5%和94.5%，二者相差仅3%，且随着时间的延续，二者的转化率没有明显的升高。所以，降解体系的PPOD活力可固定为200 U/mL，降解时间为10 min。参考文献〔13〕表明，润楠POD虽然其对BPA的降解率也达90%以上，但需要2 h的降解时间，而PPOD仅需10 min即可使BPA降解率达到91%，表明PPOD能更快速地有效催化H₂O₂氧化降解BPA。

按1.7部分设计，改变体系的pH和温度，降解10 min，考察pH、温度对降解率的影响，结果表明，当pH 4~6时，BPA降解率约92%，说明PPOD有效催化氧化降解BPA有一定的pH范围，是一个弱酸性范围。pH小于4或大于6时，降解率明显降低，不适于PPOD催化氧化BPA。这种pH对PPOD催化降解BPA的影响类似于辣根POD^〔14〕。由此可见，PPOD催化氧化降解BPA体系的pH设为6比较适宜，强酸性和偏碱性的pH环境不适于PPOD的催化氧化降解作用。

结果还表明，虽然温度为30 ℃时BPA降解率最高，为93.9%，但在10~50 ℃，BPA降解率都在90%以上，由此可见温度对BPA降解率的影响较小，表明PPOD有较宽的温度适应范围，PPOD催化活性对温度的稳定性优于莲藕POD^〔12〕，为方便起见，降解反应可在室温下进行。

按1.7部分的设计，改变H₂O₂或BPA浓度，降解10 min，考察H₂O₂和BPA浓度对降解率的影响，结果见图 6。

由图 6可知，H₂O₂浓度低于1.0 mmol/L时，BPA降解率明显较低，这显然是因为氧化剂不足。H₂O₂浓度为1.0 mmol/L时，BPA降解率最高，达到91.9%。随着H₂O₂浓度继续升高，BPA降解率却略有下降，这可能是浓度过高的H₂O₂抑制了PPOD的活性，导致BPA降解率下降，说明氧化剂H₂O₂浓度并非越大越好，本研究体系中H₂O₂最佳添加浓度为1.0 mmol/L。

由图 6还可知，BPA初始浓度为0.2~0.8 mmol/L时，降解率达99%以上，BPA浓度大于1 mmol/L时，降解率略有下降，可能是H₂O₂不足的原因。本研究体系中BPA初始浓度应控制在0.8 mmol/L。在此条件下，PPOD酶促氧化降解BPA体系的效率达到最佳效果，降解率达99%。

(1) PPOD催化H₂O₂降解BPA的最佳条件：PPOD酶活力为200 U/mL，BPA为0.8 mmol/L，H₂O₂为1.0 mmol/L，pH为6.0，室温，时间为10 min。此条件下，BPA的降解率达99.0%。表明PPOD在修复水环境方面具有较大的潜在应用价值。

(2) 为简化操作，将来可以研究通过絮凝技术从马铃薯淀粉加工废水中富集酶蛋白。为提高PPOD的使用效率，可制备固定化PPOD，提高使用频次。