A/O工艺是目前常用的污水处理工艺，其主要由缺氧反应池及好氧反应池组成，依靠有机物降解菌、反硝化菌及硝化菌等具有污染物降解能力的微生物实现对污水的净化^〔1〕。目前，对于该工艺的研究主要集中在常规运行参数（污水温度、溶解氧浓度、进水底物种类及其浓度等）方面^〔2〕，而对于该工艺中的微生物群落结构及其在不同环境条件下演变规律的研究则相对较少。已有研究表明，一定浓度的金属离子可以影响污水生物处理系统的污染物去除效能，当Fe³⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺等金属离子单独存在于污水处理系统中时，在一定的浓度范围内可以有效改善活性污泥的特性，提高其微生物的活性及数量，从而提升生化处理效能^〔3-5〕；而Co²⁺等金属离子即使在低浓度的条件下（不超过2 mg/L）也会对活性污泥表现出轻微的抑制甚至毒害作用^〔6〕。以上研究结果主要是通过测定不同金属离子浓度下污染物去除率变化情况（COD、NH₄⁺-N等）及污泥特性变化情况（污泥浓度、耗氧速率等）得出的，金属离子对活性污泥中不同种类微生物的影响及其机理还有待深入考察和研究。

本课题组以A/O反应器中的活性污泥作为研究对象，考察Fe³⁺对活性污泥理化性质及反应器处理效能的影响，同时采用Illumina MiSeq高通量测序技术，主要从微生物学角度对比分析Fe³⁺对好氧反应器中活性污泥微生物的群落结构特征及其多样性产生的影响，为金属离子强化污水生物处理效果的研究提供微生物学理论基础。

A/O试验装置由进水水箱、缺氧反应器、好氧反应器、沉淀池、出水水箱等顺序连接组成。缺氧/厌氧反应器容积50 L，采用电动搅拌器进行搅拌，好氧反应器容积100 L，采用电磁式空气泵进行曝气。污泥采用间歇回流，每隔60 min回流12 min。为便于严格控制试验条件，在系统稳定运行的条件下，从好氧反应器中取1 L活性污泥，分别加入到编号为CG（control group，对照组）和EG（experimental group，试验组）的小型间歇反应器中（如图 1所示），其容积均为2 L，两个间歇反应器中活性污泥投加量均为0.5 L，再分别加入1.5 L生活污水，对其按照好氧5.0 h、缺氧2.5 h进行培养，培养过程中对其中的污水定期更换，换水间隔8 h，污泥龄（SRT）控制在30 d。每次换水后，均在试验组中投加1 g/L的FeCl₃溶液1 mL，使间歇反应器内的Fe³⁺质量浓度始终稳定在0.5 mg/L。间歇反应器连续运行45 d后，对COD及NH₄⁺-N的去除效果进行连续测定，至以上两项指标的去除率基本趋于稳定，分别定量取两个间歇反应器中的活性污泥至10 mL离心管中，于80 ℃的低温条件下冷冻保存，进行高通量测序。

试验中的测定指标有污泥沉降比（SV₃₀）、污泥浓度（MLSS）、污泥容积指数（SVI）、化学需氧量（COD）及氨氮（NH₄⁺-N），每次测定间隔1 d。其中，SV₃₀采用30 min污泥沉降率表征，MLSS采用重量法测定，SVI由SV₃₀/MLSS计算得出；COD采用HACH DRB200消解器消解，HACH DR5000分光光度计测定；NH₄⁺-N采用纳氏试剂光度法测定。

试验对活性污泥中细菌的16S rRNA进行扩增并测序，所用引物及其对应序列为338F（5'-ACTCC-TACGGGAGGCAGCAG-3'），806R（5'-GGACTACH-VGGGTWTCTAAT-3'），扩增片段长度为468 bp，测序平台为PE300，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序。

在基因组DNA抽提完成后，采用1%琼脂糖凝胶电泳对其进行检测，检测结果表明试验组及对照组DNA质量浓度均大于80 mg/L，满足后续PCR扩增要求；PCR仪型号为ABI GeneAmp^® 9700型，扩增过程中退火温度为55 ℃，循环数27，PCR扩增产物电泳检测结果表明，目标条带浓度适宜，大小正确，满足上机测序要求。

试验过程中对活性污泥SV₃₀、MLSS及SVI的测定结果如表 1所示。

由表 1可以看出，在0.5 mg/L的Fe³⁺作用下，相比对照组，试验组活性污泥的SV₃₀降低了3.0%，SVI降低了17.7%，说明污泥沉降性能有所改善，污泥浓度由3 187 mg/L提高至3 555 mg/L，提高了11.5%。这主要是由于Fe³⁺为微生物进行生命活动所必需的微量元素，其对活性污泥的作用有效促进了其中的微生物的生长繁殖，从而使污泥浓度得到有效提高^〔7〕，同时Fe³⁺具有絮凝作用，可以促使活性污泥的絮体颗粒变大且更加密实^〔8〕，由此提高了污泥的沉降性能。间歇反应器运行45 d后试验组（EG）和对照组（CG）的COD及NH₄⁺-N去除效果分别如图 2、图 3所示。

由图 2可以看出，期间进水COD为254~355.1 mg/L，至反应器运行基本稳定后，试验组和对照组出水COD分别稳定在64.8 mg/L和68.6 mg/L以下，对应的COD平均去除率分别为79.3%和76.5%。两组反应器均表现出较好的COD去除效果，说明活性污泥中的有机物降解菌生物活性较高，并有效发挥了其有机污染物降解作用。

由图 3可以看出，试验期间反应器进水NH₄⁺-N为49.4~66.2 mg/L，至反应器运行基本稳定后，试验组及对照组出水NH₄⁺-N分别稳定在0.51 mg/L和1.5 mg/L以下，对应的NH₄⁺-N平均去除率分别为90.9%和94.4%，两组反应器对NH₄⁺-N均表现出了良好的去除效果，表明活性污泥中参与硝化反应的菌群数量丰富；Fe³⁺作用下活性污泥对于NH₄⁺-N的去除效果提升了3.5%，说明Fe³⁺对硝化菌群的生长繁殖起到了一定的促进作用。

试验组及对照组的活性污泥微生物群落多样性测定结果如表 2所示。可以看出，两个样本的多样性指数均较为相近，不存在明显区别。

图 4表示了样本中门水平上微生物群落结构及分布。

在门分类水平上，两个样本共得到8种门以上的细菌群落，主要包括Proteobacteria（变形菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Cyanobacteria（蓝藻菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Acidobacteria（酸杆菌门）、Verrucomicrobia（疣微菌门）等。其中相对丰度排在前4位的优势菌门为Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes以及Cyano-bacteria。在0.5 mg/L的Fe³⁺的作用下，活性污泥中Proteobacteria的相对丰度由32.1%提高至38.4%，提升幅度最为明显，其次分别为Firmicutes及Ver-rucomicrobia，其相对丰度分别比对照组提高了2.9%及1.2%，说明Fe³⁺的作用对以上3种菌门的生长繁殖存在促进作用；对比可知，Fe³⁺作用下Cyanobact-eria及Bacteroidetes的相对丰度分别下降了8.1%和3.2%，其他菌群的相对丰度变化均不明显。

图 5表示了样本中属水平上微生物群落结构及分布。

在属分类水平上，两个样本得到的相对丰度较高的菌属主要包括Saprospiraceae（腐螺旋菌属）、Clostridium（梭菌属）、Macellibacteroides（屠场杆状菌属）、Acinetobacter（不动杆菌属）、Comamonadaceae（丛毛单胞菌属）、Thauera（陶厄氏菌属）、Arcobacter（弓形杆菌属）等。在0.5 mg/L的Fe³⁺作用下，反应器内Saprospiraceae和Clostridium的相对丰度分别由16.7%、8.3%降低至13.0%、0.2%，说明Fe³⁺对这两种菌属存在抑制作用，而相对丰度出现上升的菌属主要包括Epulopiscium和Acinetobacter，其相对丰度分别上升了2.4%和3.2%，其他菌属的相对丰度变化则不明显。综合来看，Fe³⁺的作用对于反应器内微生物群落的种类影响不明显，但对优势种群的相对丰度存在较为明显的影响。

由不同分类水平上优势菌群的分析结果可知，活性污泥样本中检出的优势菌群在污水处理过程中主要具有降解有机污染物及脱氮的功能。

试验组及对照组活性污泥中具有有机物降解功能的主要优势菌群主要包括Saprospiraceae、Clostridium、Macellibacteroides等；Saprospiraceae在生长繁殖过程中可依靠自身产生的水解酶及蛋白质降解有机污染物，是污水处理工艺中常见的有机物降解菌之一^〔9-10〕；Clostridium为革兰氏阳性菌，多属于化能异养菌，也可以对有机物进行降解^〔11〕，其代谢产物丰富，广泛分布于自然环境中；Macellibacteroides属于Bacteroidetes，该类菌属主要参与纤维素、糖类及蛋白质等有机物的降解过程，代谢产物主要包括二氧化碳及甲酸等。

反应器中具有脱氮功能的优势菌群主要包括Acinetobacter、Comamonadaceae、Thauera等；Acinetobacter大多具有异养硝化能力，部分菌种在具有异养硝化能力的同时还具有好氧反硝化能力^〔12-13〕，是一种重要的脱氮微生物；Comamonadaceae不仅可以对污水中的有机污染物起到良好的降解作用，同时对氨氮、亚硝酸盐等污染物也有降解作用，其最适生长温度普遍在25~35 ℃之间，此外碳源、氮源等底物的浓度对其生长繁殖也产生重要影响^〔14〕；Thauera属于兼性反硝化菌，是脱氮过程中的主要反硝化菌种之一，可将硝态氮彻底还原为氮气^〔15〕。

（1）试验结果表明，在Fe³⁺的作用下，A/O反应器内的活性污泥理化性质发生了明显改变，在0.5 mg/L的Fe³⁺作用下，试验组内活性污泥的沉降性能得到有效提高，其SV₃₀及SVI分别比对照组降低了3.0%和17.7%，污泥浓度提升了11.5%。

（2）试验组及对照组对COD及NH₄⁺-N均表现出了良好的去除效果，低浓度的Fe³⁺对活性污泥的污染物去除效能有一定的促进作用，但提升幅度不明显。

（3）Fe³⁺对A/O反应器内活性污泥微生物群落多样性的相对丰度产生了影响，但并未使其菌群结构产生明显改变，在属分类水平上，试验组内Saprospiraceae和Clostridium的相对丰度产生了明显变化，分别比对照组降低了3.7%和8.1%；Epulopiscium和Acinetobacter的相对丰度分别上升了2.4%和3.2%，其他菌属的相对丰度变化不大。