中成药制药废水主要来源于中药材提取、原料药提取、水针和固体制剂的生产过程排水、辅助过程排水、冲洗水和生活污水。生产过程排水带入大量乙醇、乙酸乙酯、四氢呋喃等生产原料，使得制药废水具有COD高、难降解、色度高和生物毒性强等特点^[1]。制药废水可生化性差^[2]，直接采用生化处理难以实现达标排放，而采用Fenton-微电解等预处理工艺处理制药废水^[3]，又面临投资运行成本高、管理复杂等难题。

电-生物耦合技术可克服上述缺点，通过电极电化学氧化使部分难生化物质氧化为易生物降解物质，被微生物去除^[4]。研究表明，适当电场电压可以提高微生物细胞的新陈代谢过程、细胞分裂速度、基因表达及酶活性^[5]，从而提高难生物降解废水的处理效果^[6-7]。电-生物耦合技术处理废水时工艺占地面积小、操作维护简单、抗负荷冲击力强、处理费用低，但国内外学者对电-生物耦合技术处理制药废水的降解规律和微生物群落种群特征的研究较少。

笔者采用电-生物耦合技术处理制药废水，对门、属水平的微生物多样性进行研究，对比最佳工况下电-生物反应器阴、阳极板两侧生物膜以及0 V时生物膜之间的微生物种群多样性差异，分析电场作用对微生物多样性的影响，揭示电-生物耦合技术提高COD去除率的机理。

试验所用原水取自兰州某制药厂污水调节池。不同时段废水的水质水量变化较大，各车间生产时调节池的COD、BOD₅、pH变化情况见表 1。

该制药厂废水含有四氢呋喃、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、甲苯、氯仿、异丁醇、苯乙烯等污染物，各车间废水B/C＜0.3，可生化性差。厂内各车间均为间歇式生产，废水COD大幅度波动。

试验装置如图 1所示，主要由原水水箱、电场反应器（极板、球形填料、曝气头）、曝气机、稳压直流电源、电磁隔膜计量泵组成。电-生物反应器采用PP板焊制，尺寸为300 mm×300 mm×550 mm，内部由隔板分为两级，一级与二级的有效容积为3:2。试验时原水从一级段底部进水，通过上端隔板孔溢流至二级段，二级段底部排出。装置底部设置有曝气装置，两段各设置1块阳极板和2块阴极板，单个极板尺寸300 mm×550 mm，阳极板为钛基二氧化钌，阴极板为纯钛网，极板间距15 cm。极板之间填有D 60、90 mm的组合球形填料（体积比1:1），电磁隔膜计量泵型号WS-09-03-S，直流稳压电源型号MS303D-30V3A。

取某市政污水处理厂二沉池活性污泥进行接种，将原水用自来水稀释至COD为800 mg/L左右注入到反应器中，控制溶解氧在3~4.5 mg/L、电压为0，闷曝3 d，然后以15 L/d的流量每天逐渐增加水力负荷，直到流量增至50 L/d，保持此流量运行3周后出水COD稳定在460~510 mg/L，标志着球形填料挂膜完成，取出部分生物膜保存于低温冰箱中用于后续高通量测序；此后调节反应器电压由0 V增至27 V，电压增量为2 V或3 V，每次调整完毕驯化5 d后进行水质测定。

参照标准方法测定COD^[8]：将样品摇匀后用0.45 μm滤膜过滤，用COD-571-1型消解仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）进行消解，随后用COD-571型化学需氧量测定仪测定COD；用JPBJ-608型便携式溶解氧测定仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）测定溶解氧；采用pHSJ-3F型酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）进行pH测定。

将反应器中的球形填料取出，放入经过灭菌的一次性塑料离心管中低温保存。测试时将填料取出置于250 mL锥形瓶中，注入100 mL纯净水，在低温震荡箱（10 ℃）中恒温震荡24 h后取出，静沉2 h，取出沉淀污泥进行基因组DNA抽提，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA完整性。检测合格后，按指定测序区域合成带有barcode的特异引物，采用TransGen TransStart Fastpfu DNA Polymerase AP221-02型聚合酶、ABI GeneAmp ^®9700型PCR仪进行PCR扩增，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；参照电泳初步定量结果，用QuantiFluor^TM-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）定量检测PCR产物，之后按每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。在相似性97%的标准下获得操作分类单元，OTU通过RDP数据库中的Classifer程序进行检索分类，得出群落的微生物种类组成及相对丰度；用Mothur软件计算菌群Chao、Shannon、Simpson多样性指数；将数据批量导入Qiime软件，对OTUs表进行组间差异性分析，生成门、属分类水平上的物种丰度表。

在电-生物反应器HRT为24 h、DO为3.0~4.5 mg/L条件下，测定不同电压下电-生物反应器进出水COD，结果如图 2所示。

由图 2可知，当反应器电压由0增至10 V过程中，COD平均去除率由63.52%升至83.62%，总体呈现上升趋势。这是因为在较低电压（0~5 V）下电流较小，极板不能有效生成ClO^-和·OH等强氧化中间介质^[4]，电氧化作用不能完全发挥，废水中难生化有机物的电氧化降解效果不足。随着电压继续增加（5~10 V），阳极板的电氧化功能提高，难生化降解有机物被氧化为可生物降解物质，同时因电场可以刺激生物群落中微生物的生长代谢，提高生物酶活性^[9]，微生物对废水的降解能力得以提高，从而实现电氧化与微生物对COD的协同降解^[10]，提高了电-生物反应器对制药废水中难降解有机物的去除能力。

当反应器电压由10 V增至27 V，COD去除率呈下降趋势，平均去除率由83.62%降至35.69%。在较高电压下·OH生成量虽然不断增加，电氧化反应程度增大^[11]，但过高的电压会诱发微生物代谢失调，导致微生物降解COD功能受限^[12]。尤其当电压＞18 V后，COD去除率下降趋势更加明显，可能是电压升高导致微生物失活^[13]或死亡。电氧化增速明显低于微生物处理降低速率，总体上导致处理效率急剧下降。电-生物反应器电压为27 V时，填料上的生物膜已严重流失，此时电化学氧化对COD的去除起主要作用。

上述分析表明，电压为10 V时电氧化反应器处理效率最高，进水COD平均值为1 588 mg/L，COD平均去除率达83.62%，相对于仅微生物作用（电压为0）和电化学为主要作用（电压为27 V），COD去除率分别提高了20%、47.93%。

在电-生物反应器电压为10 V条件下，分别对阴极板（MY1）、阳极板（MY2）两侧生物膜进行样品采集，与0 V时的生物膜（AC）共同进行高通量测序。细菌群落指数如表 2所示。

如表 2所示，经PCR扩增和高通量测序后，3个微生物样品获得的有效序列数在35 136~54 895，在97%的相似度水平上对生物膜的有效序列进行多样性分析，各样本OUT分别为1 274、1 061、452。图 3、图 4分别为细菌群落丰富度稀疏曲线及Shannon指数稀释曲线。

由图 3、图 4可知，OUTs和Shannon指数随着序列数的增加而迅速上升，测序条带数量＞30 000时，OUTs曲线末端趋于平缓，测序条带数量＞5 000时，Shannon指数稀释曲线趋于饱和，说明测序深度能够覆盖细菌群落的多样性。OUTs曲线表现出3个样本之间物种差异性较大。MY1和MY2的Simpson指数大于AC，而AC的Chao指数和Shannon指数均大于MY1和MY2，说明电场作用会导致微生物物种多样性降低，但生物种群分布更加集中，优势种群集中可以提高制药废水的处理效率。

3个样本在门水平上的分类学比对情况如图 5所示。

在门水平上，3个样本共检测出36个菌门。AC、MY1和MY2样品中变形菌门（Proteobacteria）均为优势菌，丰度分别为46.88%、50.28%、72.19%。Proteobacteria为革兰氏阴性菌，大部分为兼性或专性厌氧及异养，Y. J. Liu等^[14]研究发现Proteobacteria是制药废水处理系统中COD降解的主要菌门。其次为拟杆菌门（Bacteroidetes），丰度分别为31.20%、32.87%、9.58%。Bacteroidetes是化能有机营养菌门，可降解复杂有机物（纤维素和淀粉）、脂类和蛋白质；中药提取车间废水含有纤维素，阴极发生的还原反应使O₂在新生态氢存在下还原为具有氧化活性的H₂O₂，将复杂有机污染物氧化为可被Bacteroidetes利用的中间产物，可能导致MY1中Bacteroidetes丰度较高。再次为厚壁菌门（Firmicutes），丰度分别为1.41%、9.19%、4.20%，Firmicutes在MY1中的丰度明显高于AC的丰度，M. E. Casas等^[15]和Weicheng Li等^[16]研究发现Firmicutes在抗生素废水处理中为主要优势菌门，因此电-生物反应器对处理含抗生素的废水具有优势。

反应器生物膜中Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes具有相对较高的丰度，对难降解有机物和抗生素可发挥更好的去除效果，可能是电-生物耦合技术处理制药废水效率提高的原因之一。

此外，绿弯菌门（Chloroflexi）在AC和MY1中的丰度为6.78%、2.26%，在MY2中的丰度仅为0.13%，这是因为Chloroflexi为厌氧生物，阳极电解水产生的O₂抑制了Chloroflexi的生长和繁殖。Epsilonbacteraeota在MY2中的丰度为13.43%，在AC和MY1中的丰度＜1%，Epsilonbacteraeota为之前的ε-变形菌纲^[17]，后被划分为新门，可利用H₂作为电子供体，阳极产生H₂是其丰度较高的主要原因。

属水平上3个样品共检测出601个菌属，相对丰度如图 6所示。

由图 6可知，AC样品中的主要优势菌属为腐螺旋菌属（Saprospiraceae）、SJA-28、OM27 clade、厌氧绳蝇属（Anaerolineaceae）、Chitinophagales、Sulfuritalea、陶厄氏菌属（Thauera）、PHOS-HE36、Limnohabitans和Dokdonella，其丰度分别为6.57%、5.79%、4.65%、3.02%、2.69%、2.52%、2.34%、2.29%、2.27%、2.26%。MY1样品中的主要菌属为Rivicola、动胶菌属（Zoogloea）、Paludibacter、脱硫叶菌属（Desulfobulbus）、Lentimicrobiaceae、球衣菌属（Sphaerotilus）、M2PB4-65 termite group、Methyloversatilis和噬氢菌属（Hydrogenophaga），其丰度分别为13.16%、10.03%、6.30%、4.88%、4.48%、2.51%、2.47%、1.99%、1.57%。MY2样品中的主要菌属为动胶菌属（Zoogloea）、弓形杆菌属（Arcobacter）、Rivicola、不动杆菌属（Acinetobacter）、Paludibacter、噬氢菌属（Hydrogenophaga）、Fusibacter和Cloacibacterium，其丰度分别为52.55%、12.99%、7.98%、2.96%、2.84%、1.92%、1.69%、1.33%。

电-生物反应器中，电压为10 V时的微生物菌属与电压为0时的差异明显，10 V时阴阳极板两侧微生物菌属也显示出一定差异。10 V下的微生物优势菌属较电压为0时增加了Rivicola、Zoogloea、Arcobacter、Paludibacter、Desulfobulbus、Sphaerotilus、Acinetobacter、Lentimicrobiaceae等。其中，MY1和MY2中Zoogloea丰度分别达到10.03%、52.55%，而在AC样品中其丰度仅为0.22%。Zoogloea生长过程可以利用多种糖类、糖醇、氨基酸和蛋白质，原水中乙醇含量较高，促进了以醇类为主要碳源的动胶菌属的生长繁殖；10 V时阴极活跃的电氧化反应促进了难降解物质的降解，这可能是Zoogloea在MY2的丰度达到52.55%的主要原因。同时，A. Tancsics等^[18]发现Zoogloea对甲苯也有较好的降解效果，也有研究表明Zoogloea可提高造纸废水^[19]、石油废水^[20]等难降解废水的降解效率。造纸废水、石油废水与制药废水的污染物类别相近，由此可推测出Zoogloea也是电-生物耦合技术处理制药废水的主要菌属。此外，阴阳极生物膜中的Desulfobulbus、Sphaerotilus和Acinetobacter对提高制药废水的降解效率也有重要作用。Desulfobulbus能够还原亚硫酸盐、硫酸盐和硫代硫酸盐生成H₂S，可降解葡萄糖、丙酸和丙酮酸盐生成乙酸^[21]；Sphaerotilus严格好氧，能利用多种有机物如醇、有机酸和糖类等作为碳源和能源，制药废水中的乙醇和甲醇为Sphaerotilus提供了碳源；Acinetobacter可通过氧化作用将芳香烃开环裂解并利用^[22]。

电场和不同中间产物共同导致电-生物反应器在10 V时的微生物菌属与0 V时差异明显，也使得10 V时阴、阳极板两侧的微生物菌属存在一定差异。不同的菌落结构会对废水处理效率造成影响。难降解物质在阴极和阳极发生不同反应：阳极产生的·OH可与有机物接触发生脱氢反应、亲电加成反应和电子转移反应^[23]，同时阳极表面形成的高价态氧化物MO_x+1会去除部分难降解物质^[24]；阴极附近O₂与新生态氢生成具有氧化活性的H₂O₂来氧化有机物，因此产生不同中间产物，使微生物的营养源成分存在差异，而不同菌属对营养源的摄取能力也不同，导致不同电压下电-生物反应器的微生物菌属呈现差异性。

（1）固定电-生物反应器极板间距为15 cm、HRT为24 h，DO为3~4.5 mg/L，考察电压对COD去除率的影响。结果表明，电压为10 V时COD去除率最高，初始COD为1 473.45 mg/L的原水经处理后COD去除率可达83.62%，较电压为0时COD去除率提高了20.1%。

（2）电压在0~10 V，电-生物反应器的处理效率与电压呈正相关关系，可能是电场强化了微生物功能，同时电氧化的协助作用促进了污染物降解；电压在10~27 V，处理效率与电压呈负相关关系，可能是过高的电压降低了微生物活性，导致处理效率下降。

（3）电-生物反应器为10 V时阴、阳极板两侧生物膜和0 V时生物膜的菌落多样性呈现较大差异。阴阳极板周边生物膜中的优势菌门为Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes，其对复杂有机物和抗生素等难降解物质有较好的去除作用；属水平上，Zoogloea在极板周边的相对丰度显著提高，其对制药废水中醇类、甲苯、长链烃等物质的去除起到重要作用，同时电-生物反应器生物膜中的Desulfobulbus、Sphaerotilus和Acinetobacter可以降解制药废水中的简单有机物和芳香烃。

（4）电氧化与生物降解的协同作用是提高对制药废水处理效率的主要原因之一。门水平和属水平上存在大量可以利用难生物降解物质的菌种，其对芳香烃、长链烃等物质的降解，提高了对制药废水的降解效率，同时电化学作用可将难生物降解物质转化为可被微生物利用的中间产物，提高微生物降解制药废水的效率。电氧化和生物降解之间的协同作用导致菌落结构发生较大变化，最佳电压下的菌落结构对制药废水的处理效率更高。