还原蓝4高效降解菌的分离鉴定及降解条件优化

doi:10.19965/j.cnki.iwt.2021-0071

还原蓝4高效降解菌的分离鉴定及降解条件优化

邓田田^,, 李海红^,, 王洋涛

西安工程大学环境与化学工程学院, 陕西西安 710048

Isolation and identification of high-efficiency vat blue 4 dye-degrading strain and its degradation condition optimization

DENG Tiantian^,, LI Haihong^,, WANG Yangtao

College of Environmental and Chemical Engineering, Xi'an Polytechnic University, Xi'an 710048, China

通讯作者: 李海红, E-mail: 1624116019@qq.com

收稿日期: 2021-07-16

基金资助:

陕西省科技厅社会发展领域项目. 2020SF-435
陕西省提升公众科学素质计划项目. 2020PSL021

陕西省“三秦学者”基金资助项目

Received: 2021-07-16

作者简介 About authors

邓田田（1996—），硕士研究生电话：17868811952，E-mail：2391446711@qq.com , E-mail：2391446711@qq.com

Abstract

A strain of vat blue 4(VB4) dye decolorization was isolated from the printing and dyeing activated sludge, and its degradation conditions for VB4 was optimized. Species were identified by microscopic morphology, physiologicalbiochemical properties and its 16S rRNA gene sequence analysis. Single-factor experiment was used to preliminarily determine the factors affecting VB4 degradation, and Placket-Burman experiment, steepest ascent experiment, Central Composite Design experiment and response surface analysis were used to optimize and predict the degradation conditions. The results showed that the strain was identified as Pseudomonas aruginosa, the optimal degradation conditions on VB4 were: pH 7.35, urea concentration 0.95 g/L, the temperature 35.37℃, the degradation rate reached 97%, which was 0.24% difference from the predicted value of 97.24%. The established model predicted well for treatment of VB4 dye wastewater. All the results provided some information for the effective treatment of the printing and dyeing wastewater.

Keywords： printing and dyeing wastewater ; vat blue 4 ; decolorization bacteria ; response surface analysis

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本文引用格式

邓田田, 李海红, 王洋涛. 还原蓝4高效降解菌的分离鉴定及降解条件优化. 工业水处理[J], 2021, 41(10): 83-90 doi:10.19965/j.cnki.iwt.2021-0071

DENG Tiantian. Isolation and identification of high-efficiency vat blue 4 dye-degrading strain and its degradation condition optimization. Industrial Water Treatment[J], 2021, 41(10): 83-90 doi:10.19965/j.cnki.iwt.2021-0071

印染工业是我国促进经济发展的传统产业支柱，同时也是高排放、高污染的行业，由此社会面临着加快经济发展与环境保护的巨大冲突。随着国家一系列污水排放政策的相继出台，印染企业面临的治污压力也越来越大，基于此，研究印染废水的处理变得尤为重要。研究表明，许多种类的染料都具有3致作用，“致毒、致癌、致突变”^〔1〕。若将处理不彻底的印染废水排放到环境中，不仅会降低水的透光性，还会减少水体中溶解氧的含量，干扰水中生物的生长^〔2〕。特别地，对于各种合成染料，其发色基团如偶氮基团、蒽醌基团等在水体中保留的时间较长，不易被环境吸收降解。因此，如何高效、彻底地降解合成染料成为一个亟待解决的问题。

蒽醌染料是一类含有蒽醌等环状结构的具有还原性、疏水性的染料通称，颜色以蓝色、绿色、紫色等为主^〔3-4〕。由于该类染料具有色泽艳丽、固色率高、价格低廉等优势，已成为目前印染行业中的一类不可或缺的染料，使用量仅次于偶氮染料^〔5〕。其品种主要有还原蓝4、酸性蒽醌蓝、活性艳蓝X-BR等^〔6-7〕。蒽醌染料大多数含有多环芳香族化合物，结构复杂且难降解，存在一定的潜在毒性^〔8-9〕；其产生的废水有机成分含量高、可生化性差、色度高，是众人皆知的一类难处理有机废水^〔10-12〕。

近年来，有研究报道关于蒽醌染料废水的处理方法，如Fenton氧化法、光催化氧化法等，但这些方法存在成本高、易产生二次污染的缺陷；而采用生物法处理蒽醌染料废水具有效率高、环保且成本低的优点，已成为染料废水处理研究的热点^〔13〕。目前，已筛选到可高效降解蒽醌染料的微生物包括藻类^〔14〕、真菌^〔15〕、放线菌和细菌^〔16〕，通过这些微生物的吸附、降解等过程可高效去除印染废水中的染料^〔17〕。还原蓝4（VB4）广泛用于印染行业，由于其利用率低，处理不彻底，导致大量进入到环境水体中。但由于VB4具有结构复杂、毒性大、不易被生物降解等特点，到目前为止几乎没有关于其生物降解的相关报道。为实现印染废水的有效处理，有必要研究筛选可高效降解VB4的菌株。为此，本研究利用印染废水生物氧化池的活性污泥，通过富集培养、分离纯化得到了一株高效降解VB4染料的菌株，并用响应面优化法确定了最佳降解条件。

1 材料与方法

1.1 染料

实验所用染料为还原蓝4（VB4），购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司（TCI Shanghai）。本实验所用模拟废水由还原蓝4配制而成。

1.2 培养基

无机盐培养基^〔18〕：KH₂PO₄ 1.0 g/L，NaHPO₄·12H₂O 2.0 g/L，MnSO₄·7H₂O 0.02 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，CaCl₂ 0.02 g/L，NH₄Cl 0.5 g/L，微量盐溶液2.0 mL/L。用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调节初始pH为7.0。121 ℃高压灭菌20 min，备用。

微量盐溶液：CoCl₂·6H₂O 4.0 mg/L，MnSO₄·H₂O 2.8 mg/L，H₃BO₃ 4.0 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 28.0 mg/L，MoO₃ 4.0 mg/L。0.24 μm滤膜过滤，备用。用于培养菌株时，按需加入VB4染料及其他底物。

LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化钠10 g/L。121 ℃灭菌20 min，用于菌株的活化与培养。

LB固体培养基：在液体LB培养基中需加入1.5%琼脂粉。

BM培养基：KH₂PO₄ 1.0 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2.0g/L，MnSO₄·7H₂O 0.02 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L，葡萄糖1.0 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，CaCl₂ 0.02 g/L，NH₄Cl 0.5 g/L，尿素1.0 g/L，微量盐溶液2.0 mL/L。用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调节初始pH为7.0。121 ℃高压灭菌20 min，备用。

1.3 主要仪器设备

ZQZY-C恒温培养摇床，上海知楚仪器有限公司；生化培养箱，上海恒科技有限公司；FE-20酸度计，瑞士梅特勒-托利多公司；FD-IC-50冷冻干燥仪，北京博医康实验仪器有限公司；mini-15K高速离心机，杭州奥盛仪器有限公司；SW-CJ-1G单人超净工作台，苏州净化设备有限公司；UV-3100紫外分光光度计，MAPADA公司；HIRAYAMA高压灭菌锅，德国默克公司。

1.4 菌株的富集、筛选与纯化

1.4.1 VB4高效降解菌的富集与筛选

将5 mL破碎泥水混合物即菌悬液（样品前处理所得）接入含有20 mg/L VB4的BM培养基中，置于35 ℃、200 r/min的摇床中培养。1周后吸取5 mL培养液到新鲜的含有40 mg/L VB4的BM培养液中，富集驯化，直到培养液中VB4质量浓度达到100 mg/L。保存混合菌液，观察菌群结构变化。

1.4.2 VB4高效降解菌的纯化

用超纯水稀释菌悬液（混合菌液），然后吸取50μL的稀释菌悬液涂纯化平板，于30℃恒温培养，直到明显能观察到单克隆。挑取不同形态的单克隆到液体LB中扩大培养后，在1 000 r/min下离心5 min收集菌体，然后采用BM培养液洗3遍，转接入含有VB4的BM培养液中验证脱色率。高效降解菌保存于30%的甘油中。菌体量利用细胞干重衡量。

1.5 菌株鉴定

采用电镜进行菌株形态观察，具体的生理生化鉴定方法参照《常见细菌系统鉴定手册》^〔19〕。使用16S rRNA技术对其进行种属鉴定。

1.6 单因素实验优化菌株降解条件

采用单因素实验探索不同因素对VB4高效降解菌降解VB4的影响，影响因素包括温度、初始接种量（OD₆₀₀）、培养基初始pH以及葡萄糖、尿素、微量盐、VB4初始浓度。所有样品均置于恒温摇床中培养24 h，然后于8 000 r/min下离心5 min，用紫外分光光度计在615 nm处测定上清液的吸光度，计算脱色率。收集离心后菌体，冷冻干燥至恒重，称量菌体干重，用以衡量菌体量。每组实验平行进行3次。

1.7 响应面法优化VB4高效降解菌株降解VB4的条件

1.7.1 Plackett-Burman实验

单因素实验不能确定影响因子的主次^〔20〕，采用Plackett-Burman实验（PB实验）筛选出对目标值影响最大的关键因素^〔21〕。分别选取高、中、低3个水平，具体各个因子的水平设置如表 1所示。利用Design-Export 8.0.0软件进行数据分析，以VB4脱色率为响应值，每组实验做3个平行。

表1 Plackett-Burman实验设计

Table 1 The Plackett-Burman design

因素水平	A温度/℃	B初始接种量（OD₆₀₀）	CpH	D葡萄糖/（g·L^-1）	E尿素/（g·L^-1）	F染料/（mg·L^-1）	G微量盐溶液（mL·L^-1）
高水平	40	0.08	8	1.5	1.5	80	4
低水平	30	0.04	6	0.5	0.5	20	2
中心	35	0.06	7	1	1	50	3

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1.7.2 最陡爬坡实验

响应面拟合方程只有在接近最佳值区域才能较好地模拟真实情况，故用最陡爬坡法快速逼近最大VB4脱色率区域^〔22-23〕。根据PB实验得出的一次拟合方程进行设计^〔24〕，在拟合方程中, 各因子的系数决定爬坡方向，系数大小及主要因素效应值确定变化步长^〔25-26〕。

1.7.3 CCD实验

利用响应面法中CCD实验对VB4的脱色条件进一步优化。采用CCD实验设计3因素3水平的响应面分析实验，研究主要因子对VB4脱色率的影响。实验因素水平及编码如表 2所示。为验证优化响应面模型的准确性，根据得到的最佳条件设计实验进行验证。每组实验做3个平行。

表2 CCD实验因素水平及编码

Table 2 Independent variables levels used for CCD matrix

自变量	水平
自变量	最低	低	中心	高	最高
分辨率	-1.68	-1	0	1	1.68
A-温度/℃	26.6	30	35	40	43.4
C-pH	5.32	6	7	8	8.68
E-尿素/（g·L^-1）	0.4	0.6	0.9	1.2	1.4

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2 结果与讨论

2.1 脱色菌株的筛选与鉴定

通过对印染活性污泥中的微生物进行染料脱色筛选，分离到1株能以VB4染料为唯一碳源的脱色菌株，命名为WYT。菌株WYT在LB平板上的单克隆菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，容易挑起〔见图 1（a）〕。革兰氏染色实验得该菌株呈革兰氏阴性，菌体大小为（0.5~1.0）μm×（1.0~3.0）μm，单个菌体呈短杆状，无芽孢〔见图 1（b）〕。

图1

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图1 菌株WYT的单克隆平板照片（a）和菌株WYT的负染电镜图（b）

Fig.1 Monoclonal photograph of WYT(a) and negative staining electro microscopy of WYT(b)

将菌株WYT的测序结果在Genbank数据库（登录号：MW019607）中与已有核酸序列进行相似性比对，结果显示，菌WYT与Pseudomonas aeruginosaS25具有很高的同源性（99%）。结合WYT的形态和生理生化特征，鉴定其种属为Pseudomonas aeruginosa。系统发育树如图 2所示。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 培养温度对脱色效果的影响

温度是微生物重要的生存因子。不同温度条件下，菌株WYT的生长和降解情况如图 3所示。培养基初始pH为7，初始接种量为0.02，VB4初始质量浓度为50 mg/L。

由图 3可知，菌株WYT生长和降解VB4的适宜温度范围为30~37 ℃，在35 ℃时，菌株生长量和脱色率达到最大，即35 ℃初步确定为最适温度。当温度＞35 ℃时，脱色率与菌体量急剧下降，可能是温度过高抑制了细菌的生长和酶活性，从而使脱色率下降^〔27〕。

图2

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图2 Pseudomonas aeruginosa WYT的系统发育树

Fig.2 The unrooted tree of Pseudomonas aeruginosa WYT

图3

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图3 培养温度对VB4降解的影响

Fig.3 Effect of different temperatures on VB4 degradation

2.2.2 初始接种量对脱色效果的影响

初始接种量对脱色效果的影响如图 4所示。培养基初始pH为7，培养温度为30 ℃，VB4初始质量浓度为50 mg/L。

图4

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图4 初始接种量对VB4降解的影响

Fig.4 Effect of initial biomass on VB4 degradation

由图 4可以看出，随着初始接种量的增加，VB4脱色率先升高后趋于稳定。当初始接种量为0.02时，脱色率最低，仅为62.18%。初始接种量太小，无法抵御染料的毒性，导致生物量很小，从而使脱色率较低。当初始接种量＞0.06时，VB4脱色率的增加不明显。菌株WYT的最适接种量为0.06。实验结果表明，初始生物量对VB4的降解影响很小，这有利于该菌株在实际印染废水处理中的应用。

2.2.3 培养基初始pH对脱色效果的影响

培养基初始pH对脱色效果的影响如图 5所示。培养温度为30 ℃，初始接种量为0.02，VB4初始质量浓度为50 mg/L。

图5

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图5 初始pH对VB4降解的影响

Fig.5 Effect of initial pH on VB4 degradation

由图 5可知，当pH=7时，VB4脱色率最高，达到90.07%，表明最适宜菌株WYT降解VB4的pH是7，该结果与文献〔28〕中Pseudomonas sp. WJ菌株最佳降解的pH一致。随着pH的进一步增大，脱色率下降，而生物量上升，可能是由于在碱性条件下培养基灭菌产生沉淀，后续实验中菌体吸附在沉淀物表面，造成较大的测量误差。

2.2.4 葡萄糖浓度与尿素浓度对脱色效果的影响

葡萄糖浓度与尿素浓度对脱色效果的影响如图 6所示。培养温度为30 ℃，初始接种量为0.02，培养基初始pH为7，VB4初始质量浓度为50 mg/L。

图6

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图6 葡萄糖浓度（a）与尿素浓度（b）对VB4降解的影响

Fig.6 Effect of glucose concentration(a) and urea concentration(b) on VB4 degradation

由图 6（a）可知，当葡萄糖质量浓度为1.0~1.5 g/L时，VB4脱色率超过87%，而当葡萄糖质量浓度为0~0.5 g/L和2.0~2.5 g/L时，VB4脱色率均小于80%，说明较低或较高的葡萄糖浓度都不利于菌株对VB4的降解。葡萄糖作为外加碳源，浓度较低时，不足以维持微生物的生长繁殖，导致脱色率较低；而浓度较高时，可能是由于碳代谢抑制了微生物活性，进而阻碍了三羧酸（TCA）循环^〔29〕。选取最佳葡萄糖质量浓度为1.0 g/L。由图 6（b）可知，当尿素质量浓度为1.0 g/L时，脱色率几乎达到最大，即其为最佳的尿素质量浓度。

2.2.5 不同投加量微量盐溶液对脱色效果的影响

不同投加量的微量盐溶液对脱色效果的影响如图 7所示。培养温度为30 ℃，培养基初始pH为7，初始接种量为0.02，VB4初始质量浓度为50 mg/L。

图7

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图7 不同投加量微量盐溶液对VB4降解的影响

Fig.7 Effect of trace salt solution of different concentration on VB4 degradation

由图 7可知，随着溶液中微量盐浓度的增加，VB4脱色率和生物量均先升高后降低。当添加4mL/L的微量盐溶液时，VB4脱色率和生物量最高；继续增大微量盐溶液的投加量，VB4脱色率和生物量明显下降，这一现象与Linna DU等报道的DY1菌株降解特性一致^〔30〕。实验结果表明，添加适量的微量盐溶液可能会促进WYT产生降解酶。

2.2.6 不同VB4初始浓度对脱色效果的影响

不同VB4初始浓度对脱色效果的影响如图 8所示。培养温度为30 ℃，培养基初始pH为7，初始接种量为0.02。

由图 8可知，当VB4初始质量浓度分别为50、100、200、300、400、500 mg/L时，培养72 h后的VB4脱色率分别为93.1%、91.9%、77.3%、53.5%、42.9%和29.1%，菌株的生长也受到了相应的影响，表明高浓度VB4会抑制WYT的生长及其对VB4的降解^〔31〕。当VB4初始质量浓度分别50 mg/L和100mg/L时，脱色率相近，但细胞干重不同。这可能是因为一方面不同浓度的染料对细菌的生长会产生不同影响，脱色可能是细菌本身的脱色，也可能是细菌的分泌物或发酵产物对染料的脱色，虽然最终脱色率相近，但是高染料浓度下的细菌死亡率也高；另一方面细胞干重的测量可能存在误差，导致2种浓度下的细胞干重不同。

图8

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图8 不同VB4初始浓度对VB4降解的影响

Fig.8 Effect of different VB4 concentration on VB4 degradation

2.3 响应面优化VB4降解条件

2.3.1 Plackett-Burman实验

为筛选出影响VB4降解的主要因子，选取温度、初始接种量、初始pH以及葡萄糖、尿素、微量盐、染料初始浓度设计了2水平的PB实验，结果如表 3所示。

表3 Plackett-Burman实验设计及结果

Table 3 Plackett-Burman design for factors optimization and measured response

实验序号	温度/℃	初始接种量（OD₆₀₀）	pH	葡萄糖/（g·L^-1）	尿素/（g·L^-1）	染料/（mg·L^-1）	微量盐溶液/（mL·L^-1）	脱色率/%
1	40	0.08	6	1.5	1.5	20	2	53.43
2	40	0.08	8	1.5	0.5	80	2	81.88
3	40	0.04	8	0.5	1.5	80	4	44.38
4	40	0.04	8	0.5	1.5	20	2	68.49
5	30	0.04	8	1.5	0.5	80	2	80.62
6	30	0.08	8	0.5	0.5	20	4	90.41
7	40	0.04	6	1.5	0.5	20	4	56.16
8	30	0.04	6	0.5	0.5	20	2	54.79
9	30	0.08	8	1.5	1.5	20	4	68.75
10	40	0.08	6	0.5	0.5	80	4	40.88
11	30	0.08	6	0.5	1.5	80	2	35.75
12	30	0.04	8	1.5	1.5	80	4	38.88

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实验结果表明，该菌株对VB4的脱色率分布在35.75%~90.41%范围内，说明筛选的因子对脱色率有非常显著的影响。运用Design-Export 8.0.0软件进行回归分析，结果如表 4所示。

表4 方差回归模型分析

Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for the regression model

项目	自由度	平方和	均方	F值	P值	影响排名
温度	1	404.43	404.43	9.67	0.036*	3
初始接种量	1	64.23	64.23	1.54	0.283	6
pH	1	1993.03	1993.03	47.66	0.002**	1
葡萄糖	1	168.89	168.89	4.04	0.115	4
尿素	1	753.24	753.24	18.01	0.013*	2
染料	1	105.07	105.07	2.51	0.188	5
微量盐	1	48.00	48.00	1.15	0.344	7
回归统计	7	3536.90	3536.90
误差	4	167.26	41.82
总计	11	3704.16
R²=0.955

注：*，显著（P < 0.05）；**，较显著（P < 0.01）。

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经过数据分析得到一次回归模型如下：

VB4脱色率（%）=59.53-5.81A+2.31B+ 12.89C+3.75D-7.92E-2.96F-2.00G

从表 4可知，模型的R²值为0.955，说明模型的拟合度较好；pH、尿素浓度以及温度对VB4脱色率存在显著影响，其中pH的影响最显著，其次是尿素，再次为温度；其他4个因素P值均大于0.05，对VB4脱色率没有明显影响。由此得出，初始pH、温度和尿素浓度为影响VB4脱色率的关键因素。

2.3.2 最陡爬坡实验

基于PB实验的结果，设计3个因素温度、pH和尿素的步长和方向。最陡爬坡实验结果如表 5所示。

表5 最陡爬坡实验设计及结果分析

Table 5 The design and results of steepest ascent experiment

实验序号	温度/℃	初始接种量（OD₆₀₀）	pH	葡萄糖/（g·L^-1）	尿素/（g·L^-1）	染料/（mg·L^-1）	微量盐溶液/（mL·L^-1）	脱色率/%
1	45	0.06	4	1.0	1.8	50	2	21.37
2	40		5		1.5			40.35
3	35		6		1.2			70.28
4	30		7		0.9			96.37
5	25		8		0.6			94.66
6	20		9		0.3			90.24

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由表 5可知，pH对VB4脱色率有显著正效应，而温度与尿素浓度对其有显著负效应^〔32〕，且第4组的脱色率最高，为96.37%，故以此为中心进行CCD优化。

2.3.3 CCD实验设计及结果

根据PB实验及爬坡实验的结果，确定CCD实验的因素和水平，并利用Design-Export 8.0.0设计CCD实验。CCD实验设计与结果如表 6所示。

表6 CCD实验设计及结果

Table 6 Operational variables for CCD matrix and responses

序号	变量			脱色率/%
序号	温度/℃	pH	尿素/（g·L^-1）	测定值	预测值
1	35	7	1.4	69.04	64.25
2	30	8	0.6	55.67	52.30
3	35	7	0.9	99.67	97.24
4	30	6	0.6	24.00	20.96
5	40	8	1.2	50.26	46.21
6	35	7	0.9	93.04	97.24
7	43	7	0.9	33.35	33.13
8	35	7	0.9	97.93	97.24
9	35	7	0.9	98.04	97.24
10	40	8	0.6	67.51	67.44
11	30	6	1.2	61.33	60.40
12	35	5.32	0.9	19.78	22.49
13	40	6	1.2	24.84	27.22
14	40	6	0.6	15.09	10.30
15	35	7	0.9	99.34	97.24
16	27	7	0.9	46.66	45.22
17	35	8.68	0.9	71.76	69.87
18	35	7	0.4	37.63	43.86
19	35	7	0.9	95.69	97.24
20	30	8	1.2	55.87	59.66

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基于CCD实验结果，得到如下数学回归模型：

Y=97.24-4.51A+14.10C+6.07E+6.45AC-5.63AE-8.02CE-20.03A²-18.09C²-15.30E²

方差分析结果如表 7所示。

表7 响应面模型的方差分析

Table 7 ANOVA for response surface quadratic model

误差	平方和	自由度	均方	F值	P值
A-温度	277.47	1	277.47	15.49	0.0028**
C-pH	2713.46	1	2713.46	151.53	< 0.0001***
E-尿素浓度	502.44	1	502.44	28.06	0.0003**
AC	333.21	1	333.21	18.61	0.0015**
AE	253.46	1	253.46	14.15	0.0037**
CE	514.08	1	514.08	28.71	0.0003***
A²	5761.66	1	5761.66	321.74	< 0.0001***
C²	4703.24	1	4703.24	262.64	< 0.0001***
E²	3364.57	1	3364.57	187.88	< 0.0001***
残差	179.08	10	17.91
失拟项	147.61	5	29.52	4.69	0.0575不显著
纯误差	31.46	5	6.29
所有项	16374.38	19

注：*，显著（P < 0.05）；**，较显著（P < 0.01）；***，极显著（P < 0.000 1）；R²=0.989 1；Adj R²=0.979 2；预测R²=0.927 5。

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方差分析结果表明，C、A²、C²和E² 4个因素是影响WYT降解VB4的最决定性变量（P＜0.000 1），其余因素则非常显著（P＜0.01）。模型失拟项的P值为0.057 5，说明该模型对响应值的拟合效果较好；相关系数R²=0.989 1，说明方程的拟合度很好，可以用该方程进行实验结果预测^〔33〕。

2.3.4 主效应因子间的交互作用

主效应因子间的交互作用如图 9所示。

图9

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图9 影响VB4脱色的响应面及等值线图

Fig.9 Response surface and contour plot of the VB4 degradation rate

由图 9（a）可知，温度与培养基初始pH的交互作用显著。VB4脱色率随着温度和pH的增加先迅速上升，然后迅速下降，在温度为35 ℃，pH为7.0时，脱色率最高。图 9（c）与图 9（d）展示了温度与尿素浓度对脱色率的影响，可明显看到最优条件包含在测试的范围内。图 9（e）中的2个轴相对陡峭，说明培养基初始pH和尿素浓度的相互作用对VB4脱色有显著影响。

CCD实验结果表明，温度、初始pH及尿素浓度之间的交互作用均显著。利用模型得出VB4脱色率的最大预测值为97.24%，最佳的脱色条件：温度35.37 ℃，pH 7.35，尿素质量浓度0.95 g/L。

2.3.5 模型验证

为了验证模型的准确性和有效性，按照优化后的VB4脱色条件进行3组平行实验，24 h后测定脱色率。结果表明，与初始条件相比，脱色率从85%提高到97%。由模型预测的脱色率为97.24%，非常接近实际值，说明模型能够比较准确地预测各因素对VB4脱色率的影响。

3 结论

（1）本研究从印染活性污泥中筛选分离到1株能降解VB4染料的脱色菌株，经过菌落形态观察、生理生化鉴定以及16S rRNA测序分析，初步鉴定为假单胞菌属，暂命名为WYT。

（2）通过单因素实验得到菌株WYT降解VB4的最佳条件：培养温度35.0 ℃，初始接种量0.06，pH 7.0，葡萄糖1.0 g/L，尿素1.0 g/L，VB4初始质量浓度50 mg/L，微量盐溶液投加量2 mL/L。

（3）采用Placket-Burman实验设计筛选出影响WYT菌株降解VB4的主要因素为温度、尿素浓度和初始pH，其中初始pH为影响最大的因素。应用响应面实验确定了WYT菌株降解VB4的最佳条件：温度35.37 ℃，尿素质量浓度0.95 g/L，pH 7.35，在此条件下VB4脱色率可达97.0%。

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... 印染工业是我国促进经济发展的传统产业支柱，同时也是高排放、高污染的行业，由此社会面临着加快经济发展与环境保护的巨大冲突.随着国家一系列污水排放政策的相继出台，印染企业面临的治污压力也越来越大，基于此，研究印染废水的处理变得尤为重要.研究表明，许多种类的染料都具有3致作用，“致毒、致癌、致突变”^〔1〕.若将处理不彻底的印染废水排放到环境中，不仅会降低水的透光性，还会减少水体中溶解氧的含量，干扰水中生物的生长^〔2〕.特别地，对于各种合成染料，其发色基团如偶氮基团、蒽醌基团等在水体中保留的时间较长，不易被环境吸收降解.因此，如何高效、彻底地降解合成染料成为一个亟待解决的问题. ...

Removal of various cationic dyes from aqueous solutions using a kind of fully biodegradable magnetic composite microsphere

2013

活性蓝FNR降解脱色菌的培养及其脱色性能的研究

2012

... 蒽醌染料是一类含有蒽醌等环状结构的具有还原性、疏水性的染料通称，颜色以蓝色、绿色、紫色等为主^〔3-4〕.由于该类染料具有色泽艳丽、固色率高、价格低廉等优势，已成为目前印染行业中的一类不可或缺的染料，使用量仅次于偶氮染料^〔5〕.其品种主要有还原蓝4、酸性蒽醌蓝、活性艳蓝X-BR等^〔6-7〕.蒽醌染料大多数含有多环芳香族化合物，结构复杂且难降解，存在一定的潜在毒性^〔8-9〕；其产生的废水有机成分含量高、可生化性差、色度高，是众人皆知的一类难处理有机废水^〔10-12〕. ...

Sequestration of Reactive Blue 4 by free and immobilized Bacillus subtilis cells and its extracellular polysaccharides

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Literature review on textile wastewater characterisation

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Recent advances in new generation dye removal technologies: Novel search for approaches to reprocess wastewater

2015

... 近年来，有研究报道关于蒽醌染料废水的处理方法，如Fenton氧化法、光催化氧化法等，但这些方法存在成本高、易产生二次污染的缺陷；而采用生物法处理蒽醌染料废水具有效率高、环保且成本低的优点，已成为染料废水处理研究的热点^〔13〕.目前，已筛选到可高效降解蒽醌染料的微生物包括藻类^〔14〕、真菌^〔15〕、放线菌和细菌^〔16〕，通过这些微生物的吸附、降解等过程可高效去除印染废水中的染料^〔17〕.还原蓝4（VB4）广泛用于印染行业，由于其利用率低，处理不彻底，导致大量进入到环境水体中.但由于VB4具有结构复杂、毒性大、不易被生物降解等特点，到目前为止几乎没有关于其生物降解的相关报道.为实现印染废水的有效处理，有必要研究筛选可高效降解VB4的菌株.为此，本研究利用印染废水生物氧化池的活性污泥，通过富集培养、分离纯化得到了一株高效降解VB4染料的菌株，并用响应面优化法确定了最佳降解条件. ...

Technical, economic and energy assessment of an alternative strategy for mass production of biomass and lipid from microalgae

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Biodecolorization of brilliant green carpet industry dye using three distinct Pleurotus spp

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一株活性黑染料脱色菌株的分离及其特性研究

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... 无机盐培养基^〔18〕：KH₂PO₄ 1.0 g/L，NaHPO₄·12H₂O 2.0 g/L，MnSO₄·7H₂O 0.02 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，CaCl₂ 0.02 g/L，NH₄Cl 0.5 g/L，微量盐溶液2.0 mL/L.用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调节初始pH为7.0.121 ℃高压灭菌20 min，备用. ...

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... 采用电镜进行菌株形态观察，具体的生理生化鉴定方法参照《常见细菌系统鉴定手册》^〔19〕.使用16S rRNA技术对其进行种属鉴定. ...

Effect of temperature and additional carbon sources on phenol degradation by an indigenous soil Pseudomonad

2005

... 单因素实验不能确定影响因子的主次^〔20〕，采用Plackett-Burman实验（PB实验）筛选出对目标值影响最大的关键因素^〔21〕.分别选取高、中、低3个水平，具体各个因子的水平设置如表 1所示.利用Design-Export 8.0.0软件进行数据分析，以VB4脱色率为响应值，每组实验做3个平行. ...

Optimization of phenol degradation by Candida tropicalis Z-04 using Plackett-Burman design and response surface methodology

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Statistical optimization of process parameters on biohydrogen production from glucose by Clostridium sp

2008

... 响应面拟合方程只有在接近最佳值区域才能较好地模拟真实情况，故用最陡爬坡法快速逼近最大VB4脱色率区域^〔22-23〕.根据PB实验得出的一次拟合方程进行设计^〔24〕，在拟合方程中, 各因子的系数决定爬坡方向，系数大小及主要因素效应值确定变化步长^〔25-26〕. ...

响应面优化法在纤维素酶合成培养基设计上的应用

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食油假单胞菌DT4菌株对四氢呋喃(THF)的降解特性

2011

... 由图 3可知，菌株WYT生长和降解VB4的适宜温度范围为30~37 ℃，在35 ℃时，菌株生长量和脱色率达到最大，即35 ℃初步确定为最适温度.当温度＞35 ℃时，脱色率与菌体量急剧下降，可能是温度过高抑制了细菌的生长和酶活性，从而使脱色率下降^〔27〕. ...

一株苯乙烯高效降解菌的分离鉴定及降解特性研究

2014

... 由图 5可知，当pH=7时，VB4脱色率最高，达到90.07%，表明最适宜菌株WYT降解VB4的pH是7，该结果与文献〔28〕中Pseudomonas sp. WJ菌株最佳降解的pH一致.随着pH的进一步增大，脱色率下降，而生物量上升，可能是由于在碱性条件下培养基灭菌产生沉淀，后续实验中菌体吸附在沉淀物表面，造成较大的测量误差. ...

Inactivation of the Pta-AckA pathway causes cell death in Staphylococcus aureus

2013

... 由图 6（a）可知，当葡萄糖质量浓度为1.0~1.5 g/L时，VB4脱色率超过87%，而当葡萄糖质量浓度为0~0.5 g/L和2.0~2.5 g/L时，VB4脱色率均小于80%，说明较低或较高的葡萄糖浓度都不利于菌株对VB4的降解.葡萄糖作为外加碳源，浓度较低时，不足以维持微生物的生长繁殖，导致脱色率较低；而浓度较高时，可能是由于碳代谢抑制了微生物活性，进而阻碍了三羧酸（TCA）循环^〔29〕.选取最佳葡萄糖质量浓度为1.0 g/L.由图 6（b）可知，当尿素质量浓度为1.0 g/L时，脱色率几乎达到最大，即其为最佳的尿素质量浓度. ...

Biodegradation of malachite green by Pseudomonas sp

2011

... 由图 7可知，随着溶液中微量盐浓度的增加，VB4脱色率和生物量均先升高后降低.当添加4mL/L的微量盐溶液时，VB4脱色率和生物量最高；继续增大微量盐溶液的投加量，VB4脱色率和生物量明显下降，这一现象与Linna DU等报道的DY1菌株降解特性一致^〔30〕.实验结果表明，添加适量的微量盐溶液可能会促进WYT产生降解酶. ...

Decolorization of the textile dyes by newly isolated bacterial strains

2003

... 由图 8可知，当VB4初始质量浓度分别为50、100、200、300、400、500 mg/L时，培养72 h后的VB4脱色率分别为93.1%、91.9%、77.3%、53.5%、42.9%和29.1%，菌株的生长也受到了相应的影响，表明高浓度VB4会抑制WYT的生长及其对VB4的降解^〔31〕.当VB4初始质量浓度分别50 mg/L和100mg/L时，脱色率相近，但细胞干重不同.这可能是因为一方面不同浓度的染料对细菌的生长会产生不同影响，脱色可能是细菌本身的脱色，也可能是细菌的分泌物或发酵产物对染料的脱色，虽然最终脱色率相近，但是高染料浓度下的细菌死亡率也高；另一方面细胞干重的测量可能存在误差，导致2种浓度下的细胞干重不同. ...

一株苯酚降解菌的分离鉴定及响应面法优化其固定化

2014

... 由表 5可知，pH对VB4脱色率有显著正效应，而温度与尿素浓度对其有显著负效应^〔32〕，且第4组的脱色率最高，为96.37%，故以此为中心进行CCD优化. ...

1株对叔丁基邻苯二酚降解菌的筛选鉴定及响应面法优化其降解

2015

... 方差分析结果表明，C、A²、C²和E² 4个因素是影响WYT降解VB4的最决定性变量（P＜0.000 1），其余因素则非常显著（P＜0.01）.模型失拟项的P值为0.057 5，说明该模型对响应值的拟合效果较好；相关系数R²=0.989 1，说明方程的拟合度很好，可以用该方程进行实验结果预测^〔33〕. ...

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