工农业生产的发展以及化肥的大量施用导致了氮化合物在水体中的不良积累及过量排放^〔1〕，过量的氮排放将导致水体富营养化，并对人类健康产生潜在危害。通常，水体不发生富营养化的环境阈值约为0.2 mg/L的总氮（TN）^〔2〕，按我国《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB 18918—2002）一级A标准，TN的最高允许排放质量浓度为15 mg/L。因此，满足一级A标准的污水处理厂排出的尾水并不能阻止水体的富营养化，并且现在很多污水处理厂都面临出水TN不能稳定达标的问题。因此，寻求进一步减少污水处理厂尾水总氮排放的低成本技术势在必行。

由元素硫驱动的自养反硝化技术是一种相对高效、经济、安全的脱氮技术^〔3〕，适用于缺少碳源的污水处理厂尾水的进一步处理。但是，硫自养反硝化过程是产H⁺并消耗碱度的过程，而脱氮硫杆菌生长的最适pH为7，且硫自养反硝化需要无机碳源作为能量来源。

铁在自然界中分布广泛，主要以碳酸盐、氧化物、硫酸盐等铁矿物的形式存在^〔4〕。研究发现，菱铁矿（主要成分为FeCO₃）能驱动硝酸盐向氮气的转化，相应的反应见式（1）^〔5〕。

FeCO₃自养反硝化过程会产生碱度和碳酸根，能够缓冲体系pH的变化，并且可以为系统中的自养微生物提供无机碳源，FeCO₃也可作为电子供体参与自养反硝化，此外，若将硫自养反硝化与FeCO₃自养反硝化耦合，对于相同的进水NO₃^--N负荷还可以减少SO₄^2-的生成^〔6〕。因此，面对污水处理厂尾水提质增效的实际需求，开展硫/菱铁矿自养脱氮工艺的研究具有极大的理论意义和实际应用意义。

硫自养反硝化会导致碱度消耗，以及SO₄^2-和NO₂^--N的积累，通过引入菱铁矿可以缓解上述问题。但是，水力停留时间（HRT）作为硫/菱铁矿自养反硝化系统的关键参数之一^〔7〕，其不仅会影响系统的脱氮效果，也会影响反应器的体积，更长的HRT需要更大的占地面积，将导致成本与能耗的增加。而且，HRT对系统的协同脱氮效率、氮的中间产物、SO₄^2-浓度、FeCO₃自养反硝化的脱氮贡献率以及微生物群落丰度与结构变化的影响还没有详细的报道。基于此，本研究拟通过揭示HRT对硫/菱铁矿自养脱氮系统的影响规律，寻求减少中间产物积累和SO₄^2-生成的方法，对硫/菱铁矿自养反硝化技术的实际应用具有指导意义。

实验装置如图1所示，采用圆柱形反应器，材质为有机玻璃，反应器内径为10 cm，高30 cm，反应器内等体积混合填充粒径为2~5 mm的硫颗粒和菱铁矿颗粒，有效填充高度为25 cm，有效填充体积为1.96 L。反应器采用上向流方式连续进水，实验所用硫颗粒为工业用硫磺颗粒，S的质量分数为99.9%，所用菱铁矿购自贵州矿山，其主要组分为FeCO₃。实验过程中改变反应器的HRT分别为6、12、18 h，探究反应器对污染物的去除效果、FeCO₃自养反硝化的脱氮贡献率及系统的微生物群落变化。

种泥取自实验室连续运行的自养反硝化反应器（该反应器的初始接种污泥质量浓度为2 040 mg/L）中的硫颗粒及菱铁矿颗粒上附着的膜状污泥。实验过程中反应器的进水为自来水配制的人工合成废水，NO₃^--N在反应器中的质量浓度为（36.33±0.75） mg/L，废水中其他添加物质为：NaHCO₃ 500 mg/L，KH₂PO₄ 2.7 mg/L，微量元素1 mL/L。微量元素溶液组成为：ZnSO₄·7H₂O 0.5 g/L，CoCl₂·6H₂O 0.5 g/L，CuSO₄·5H₂O 0.1 g/L，CaCl₂ 1.0 g/L，MnCl₂·4H₂O 0.1 g/L，FeCl₃·6H₂O 0.2 g/L，Na₂ MoO₄·4H₂O 0.5 g/L。废水初始pH=（7.0±0.3）。

实验所采用的水质检测方法均参照国家环境保护总局《水和废水监测分析方法（第4版）》。采用紫外分光光度法测定NO₃^--N；采用N-（1-萘基）乙二胺分光光度法测定NO₂^--N；采用纳氏试剂分光光度法测定NH₄⁺-N；采用瑞士万通离子色谱仪882 compact IC plus检测SO₄^2-浓度；采用梅特勒-托利多FE20K pH计测定pH。

为探究HRT对系统生物种群结构及多样性的影响，在HRT=6、12、18 h这3个工况下系统运行稳定时，分别从反应器中部的硫/菱铁矿颗粒上等量剥落生物膜进行Illumina高通量测序，取出的生物膜样品依次编号为D6（HRT=6 h）、D12（HRT=12 h）、D18（HRT=18 h）。

硫/菱铁矿自养反硝化系统中FeCO₃自养反硝化和硫自养反硝化对氮脱除的贡献率的计算方法见式（2）~式（5）^〔8〕。

式中： n₁——1个NO₃^--N被还原为N₂需要的电子数目，取5；

n₂——1个NO₃^--N被还原为NO₂^--N需要的电子数目，取2；

n₃——1个S被氧化为SO₄^2-可提供的电子数目，取6；

C₁——进出水NO₃^--N差值，g/L；

C₂——进出水NO₂^--N差值，g/L；

C₃——进出水SO₄^2-质量浓度差值，g/L；

M₁——N元素的摩尔质量，取14 g/mol；

M₂——SO₄^2-的摩尔质量，取96 g/mol；

X——系统中污水被处理所需要的电子浓度，mol/L；

X_S——硫自养过程中单质硫提供的电子浓度，mol/L；

N_S——硫自养反硝化对氮脱除的贡献率，%；

N_F——FeCO₃自养反硝化对氮脱除的贡献率，%。

HRT=6、12、18 h时，反应器对氮素的去除效果见图2。

由图2可知，当HRT=6、12、18 h时，在稳定运行阶段，反应器对NO₃^--N均有很好的去除效果，平均去除率分别为99.12%、99.48%、99.93%。HRT=6 h和12 h时，反应器中存在NO₂^--N积累，稳定运行阶段其出水平均NO₂^--N分别为3.098、0.743 mg/L；HRT=18 h时，反应器内几乎无NO₂^--N的积累。Wei WANG等^〔2〕的研究表明，当HRT偏小（HRT=6 h和12 h）时，自养反硝化系统的出水中就会有NO₂^--N的积累，与本研究结果类似。Fangmin CHEN等^〔9〕的研究结果表明，S⁰对NO₃^--N的亲和力显著高于对NO₂^--N的亲和力，当HRT较低时，废水与填料没有充足的接触时间，导致NO₃^--N的还原速率大于NO₂^--N的还原速率，NO₃^--N被还原为NO₂^--N后无法及时被还原为N₂，因而产生了NO₂^--N的积累。此外，随着HRT的增大，NH₄⁺-N积累量逐渐上升，当HRT=6、12、18 h时，反应器在稳定运行阶段的平均出水NH₄⁺-N分别为0.136、0.625、1.182 mg/L，这是因为当HRT增加，HRT过长致使反应器中的部分微生物因缺少营养物质而死亡，从而释放出少量NH₄⁺-N。由图2还可以看出，当HRT=6、12、18 h时，硫/菱铁矿自养反硝化系统对总无机氮（TIN）的平均去除率分别为90.30%、95.67%、96.60%。综上，HRT=12 h时系统对TIN的去除率达到95%以上，继续增大HRT，系统对TIN的去除率没有明显的变化，反而会导致NH₄⁺-N的积累，而当HRT=6 h时，由于NO₂^--N的积累也会使TIN去除率降低，因此，HRT=12 h对于硫/菱铁矿自养反硝化系统的脱氮较为适宜。

HRT=6、12、18 h时，系统出水SO₄^2-浓度及pH的变化见图3。

由图3可知，HRT从6 h增加到12 h时，反应器出水SO₄^2-的平均质量浓度从193.14 mg/L降至181.26 mg/L，而HRT从12 h增加到18 h时，反应器出水SO₄^2-的平均质量浓度略微上升至184.14 mg/L；当进水pH稳定在7.10左右时，HRT从6 h增加到12 h时反应器出水pH从6.18上升至6.56，HRT进一步增加到18 h时，系统出水pH相对稳定，为6.58。推测其原因为，当HRT从6 h增加到12 h时，FeCO₃自养脱氮对氮脱除的贡献率增加，因此反应器出水SO₄^2-浓度减少，pH上升；而当HRT进一步增加到18 h时，FeCO₃自养脱氮对氮脱除的贡献率基本不变，因此出水SO₄^2-浓度和pH基本不变。

HRT=6、12、18 h时，FeCO₃自养和硫自养脱氮对氮脱除的贡献率见图4。

由图4可知，HRT=6、12、18 h时，稳定运行阶段FeCO₃自养脱氮对氮脱除的贡献率分别为13.64%、20.49%、20.78%。有研究表明，硫自养反硝化产生的H⁺可能会促进FeCO₃中Fe²⁺的溶出，将微生物在菱铁矿上（固相）的反应扩大至固液两相^〔10〕，当HRT从6 h增加到12 h时，铁自养反硝化微生物有足够的停留时间利用溶出的Fe²⁺将NO₃^--N还原，因而FeCO₃参与反硝化脱氮对氮脱除的贡献率增加。当HRT继续增加到18 h时，FeCO₃自养脱氮对氮脱除的贡献率基本不变，说明进一步增加HRT对FeCO₃自养脱氮贡献率的提升没有帮助。FeCO₃自养脱氮对氮脱除贡献率的变化规律与2.2节所探讨的系统出水SO₄^2-浓度及pH的变化相一致，即当FeCO₃自养脱氮对氮脱除的贡献率增加时，出水SO₄^2-浓度减少，pH上升。

样品D6、D12、D18的微生物物种丰富度及多样性指数见表1。

由表1可知，HRT=12 h时，系统内Ace和Chao指数最大，此时系统内物种丰度最高，此外其Shannon指数最大，Simpson指数较小，说明微生物多样性也较高，这可能源于适宜的HRT使得系统中的微生物有较充足的营养物质。

样品D6、D12、D18的韦恩图见图5。

由图5可知，3个样本获得的OTU总数为440，其中，共同所有的OTU数目为104，占3个样本总OTU数目的23.6%，这说明3个样本的生物多样性存在较大差异，不同HRT条件下的硫/菱铁矿自养反硝化系统在菌群结构上发生了明显的演替和变化，HRT的改变对硫/菱铁矿自养反硝化系统的生物多样性有显著影响。

图6为样品D6、D12、D18中微生物组成的门水平分布。

由图6可知，硫/菱铁矿自养反硝化系统中最主要的菌门为变形菌门（Proteobacteria）、弯曲杆菌门（Campilobacterota）、酸杆菌门（Acidobacteriota）。随着HRT的增加，Proteobacteria的相对丰度逐渐增加，在3个样本中分别为85.87%、96.36%、98.73%；而 Campilobacterota和Acidobacteriota的相对丰度随着HRT的增加逐渐降低。Proteobacteria中存在很多典型的硝酸盐还原菌和铁氧化菌^〔11〕，系统中Proteobacteria的相对丰度远大于其他菌门，说明功能菌在系统中逐渐富集。

图7为3个样本D6、D12、D18在属分类水平下的热图。

由图7可知，样品D6中的主要菌属有Thiobacillus、Sulfurimonas、Ferritrophicum、Comamonas、unclassified_o_Burkholderiales和Geothrix，各菌属相对丰度分别为74.46%、11.19%、3.12%、1.93%、1.30%、1.12%。样品D12中的主要菌属有Thiobacillus、Comamonas、Thiomonas、Ferritrophicum、Thermomonas，各菌属相对丰度分别为82.35%、3.94%、1.62%、1.14%、1.12%。样品D18中的主要菌属有Thiobacillus、Comamonas，相对丰度分别为93.70%、1.68%。

Thiobacillus和Sulfurimonas属于Proteobacteria菌门，是典型的硫自养反硝化细菌^〔1，12〕。研究发现，某些种类的Thiobacillus也可以使用Fe（Ⅱ）作为电子供体^〔13〕，因此可以利用硫和Fe（Ⅱ）的Thiobacillus可能在系统脱氮中发挥重要作用。作为硫/菱铁矿自养反硝化系统中相对丰度最大的菌属，随着HRT的增加，Thiobacillus的相对丰度从74.46%逐渐增加至93.7%，表明HRT的增加有利于其生长繁殖；与此相反，随着HRT的增加，Sulfurimonas的相对丰度降低，说明Thiobacillus比Sulfurimonas更容易利用硫和FeCO₃作为电子供体，相同的现象在Ruihua LI等^〔14〕对磁黄铁矿-硫-石灰石自养反硝化生物滤池的研究中也被发现。Thiomonas是一种在很多硫自养反硝化系统中被检测到的自养硫化物氧化细菌^〔15〕。Ferritrophicum也属于Proteobacteria菌门，是一种可以利用硝酸盐作为电子受体氧化Fe（Ⅱ）和硫化物的细菌^〔16-17〕。Thermomonas是一种异养反硝化细菌，在进水没有有机物的情况下，可以利用细菌分泌和死亡后释放的有机物^〔18〕作为碳源，其同时也被报道是一种自养反硝化细菌，能够在缺乏有机物条件下利用无机碳源将硝酸盐还原为氮气^〔19〕。Comamonas经常在氧化Fe（Ⅱ）还原硝酸盐的环境中被检测到^〔20-21〕。HRT=18 h时，还存在内源反硝化细菌unclassified_f_Comamonadaceae^〔22〕，进一步证明过长的HRT使得系统中的微生物缺乏营养物质。综上，同时存在的自养、异养和内源脱氮细菌保证了系统高效稳定的脱氮性能，另外，系统中存在的铁还原菌Geothrix对Fe（Ⅱ）和Fe（Ⅲ）的循环也起到了重要作用^〔13〕。

（1）改变硫/菱铁矿自养反硝化组合系统的HRT，探究HRT对硫/菱铁矿自养反硝化系统运行性能的影响，结果表明，在进水NO₃^--N为36 mg/L时，当HRT由6 h增加到12 h，系统的TIN去除率从90.30%增加到95.67%，FeCO₃自养反硝化脱氮对氮脱除的贡献率由13.64%增加至20.49%，出水SO₄^2-质量浓度从193.14 mg/L降至181.26 mg/L，pH从6.18上升至6.56；当HRT进一步增加到18 h时，系统脱氮效果及FeCO₃自养脱氮贡献率受到的影响较小，反而会导致NH₄⁺-N的积累。因此，HRT=12 h对于硫/菱铁矿自养反硝化系统较为适宜。

（2）Proteobacteria菌门的Thiobacillus菌属是系统中占据绝对优势的自养反硝化细菌，同时还存在Sulfurimonas、Ferritrophicum、Thermomonas、Geothrix等功能细菌保证了系统的脱氮性能与Fe的循环。