强化生物除磷（Enhanced biological phosphorus removal，EBPR）工艺通过厌氧和好氧的交替运行，在活性污泥系统中能够富集类聚磷微生物，通过好氧末端排泥的方法达到污水除磷的目的^〔1〕。该工艺具有处理费用低、可持续运行等优点，在世界范围内被广泛接受并应用^〔2〕。以往研究表明，属于Proteobacteria（变形菌门）的Candidatus Accumulibacter（假丝酵母菌）被认为是最重要的聚磷菌（PAOs）^〔3〕。可是，在许多其他的EBPR系统中，检测到高丰度存在的属于Actinobacteria（放线菌门）的Tetrasphaera（四球虫属），占细菌总生物量的30%^〔4〕。因此，在某些EBPR系统中，Tetrasphaera可能是比Candidatus Accumulibacter更为重要的聚磷菌属。

Tetrasphaera在厌氧条件下消耗氨基酸，随后在好氧条件下吸收磷^〔5〕。蛋白质是生活污水的主要成分（占有机物的25%~35%）^〔6〕，氨基酸是Tetrasphaera和许多其他细菌的重要底物^〔7〕，而醋酸盐和丙酸盐则是Candidatus Accumulibacter的重要底物^〔8〕。然而，EBPR系统的所有代谢模型都是基于醋酸盐和葡萄糖^〔6〕开发的，不包括氨基酸的使用。实际上，在厌氧好氧条件下的EBPR系统中添加某些氨基酸后，已经观察到典型的释磷和吸磷过程，但是其贮藏产物和代谢途径仍然未知。

酪蛋白水解物（Cas aa）水解后的主要成分是氨基酸和小肽，而氨基酸是Tetrasphaera的重要底物，已有研究表明利用Cas aa作碳源可以促进Tetrasphaera的富集^〔9〕。然而，目前针对以Cas aa为碳源的研究较少，也限制了对于生物除磷系统过程的深入了解。本研究以Cas aa为唯一碳源，富集培养PAOs，并探讨不同污泥龄（SRT）条件下EBPR的处理效能，考察系统中的菌群结构及其变化，以期为EBPR工艺的稳定运行提供参考。

实验装置见图1。

采用总容积为15 L，有效容积为12 L的SBR反应装置。反应器主体由双层有机玻璃制成，内层为反应区，外层为保温区。采用底部进水、中部出水的方式，辅以蠕动泵和电磁阀实现自动进出水，上部设有溢流口，内置电动搅拌器保证反应混合均匀。

本研究中，种泥采用贮存于4 ℃冰箱中的厌氧-好氧序批式反应器（AO-SBR）污泥，颜色呈褐色，反应器初始污泥质量浓度为2 500 mg/L左右，闷曝72 h，使其恢复活性。

反应器进水采用人工合成废水，具体成分为：COD（Cas aa）300 mg/L，P（K₂HPO₄、KH₂PO₄）15 mg/L，N（NH₄Cl）15 mg/L，MgSO₄·7H₂O 118 mg/L，CaCl₂·2H₂O 56 mg/L，ATU（烯丙基硫脲）14 mg/L，NaHCO₃ 167 mg/L，微量元素0.5 mL/L。每L微量元素溶液包括：KI 0.18 g、H₃BO₃ 0.15 g、CoCl₂·6H₂O 0.15 g、MnCl₂·4H₂O 0.12 g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.06 g、ZnSO₄·7H₂O 0.12 g、CuSO₄·5H₂O 0.03 g、FeCl₃·6H₂O 1.50 g和EDTA 10.00 g^〔10〕。

在本研究中，采用配有机械搅拌器的SBR来研究SRT对EBPR的影响。反应器每天运行4周期，每个周期包括进水阶段（10 min）、厌氧阶段（120 min）、好氧阶段（150 min）、沉淀阶段（70 min）、出水阶段（10 min）。好氧段采用气泵供气，通过气体流量计调节曝气量，好氧阶段末期DO约为7.0 mg/L。反应器每周期进水6 L，充水比为50%，1 d内反应器进水总体积为24 L，水力停留时间（HRT）为12 h。通过在每日第一周期好氧阶段末期排泥，将系统运行分为3个阶段，第1阶段SRT为15 d（1~80 d），排泥量为800 mL；第2阶段SRT为20 d（81~140 d），排泥量为600 mL；第3阶段SRT为10 d（141~170 d），排泥量为1 200 mL。3个阶段除SRT不同外，其余参数均保持一致。在系统整个运行期间，采用恒温槽将温度控制在（15+1） ℃，投加NaHCO₃控制进水pH为7.4。

磷酸盐（PO₄^3-）采用钼锑抗分光光度法测定；COD采用15 min快速消解法测定；MLSS和MLVSS采用重量法测定。糖原（Gly）测定方法根据A.OEHMEN等^〔11〕所述进行了修改，取一定量的冻干泥样，然后加入5 mL 0.6 mol/L HCl溶液后，在100 ℃下消化5 h。多聚磷酸盐（Poly-P）的含量根据总磷（TP）和MLVSS计算^〔12〕。使用DO和pH探头测量 DO、pH及温度（Multi 340i，德国WTW公司）。采用16S rRNA基因测序法进行菌群鉴定^〔13〕。

反应器以Cas aa为唯一有机碳源，进水PO₄^3-和COD分别为（15+1） mg/L和（300+10） mg/L，在（15+1） ℃的条件下运行170 d，考察系统运行的3个不同阶段内PO₄^3-及COD的浓度变化，结果见图2。

由图2（a）可知，在SRT=15 d的条件下运行80 d，反应器运行初期出水PO₄^3-变化较大，从13.66 mg/L下降为1.10 mg/L，随后系统运行达到稳定，出水PO₄^3-为0.71 mg/L；当调整SRT=20 d时，出水PO₄^3-增加到5.70 mg/L，随后系统运行达到稳定状态，出水平均PO₄^3-维持在3.01 mg/L，SRT延长可能会使污泥老化，污泥更新缓慢，不利于PAOs充分发挥其除磷能力，所以改变SRT后系统除磷性能变差；在SRT=10 d的条件下，系统运行稳定期出水平均PO₄^3-为7.86 mg/L，当SRT较短时，系统便具有低浓度的活性污泥，结合高通量测序结果表明，该阶段PAOs急剧减少，使得系统除磷性能继续恶化。以上结果表明，EBPR系统在SRT为15 d的条件下稳定运行时，除磷效果最佳。

由图2（b）可知，SRT=15 d时，系统出水COD无明显变化，均小于10 mg/L；调整SRT=20 d时，系统运行前2 d出水COD提高到65 mg/L，随着运行时间的增加，出水COD又趋于稳定，最终出水COD小于40 mg/L；继续调整SRT=10 d，系统运行稳定时出水COD均小于30 mg/L。图中数据表明，当延长SRT时，系统出水COD有所提高，这可能是因为一方面SRT变长，排泥量减少，生物新陈代谢产生的物质和死亡细胞产生的难以分解的部分难以随剩余污泥排出反应器，使得反应器中有机物质含量提高；另一方面SRT变长，污泥浓度升高，污泥负荷降低，营养物质不足引起内源代谢加剧，产生更多的内源代谢物，这部分物质随水排出，导致出水COD略有提高。但各阶段运行稳定时出水COD均小于50 mg/L，说明在以Cas aa为唯一碳源的EBPR系统中，SRT的改变对微生物吸收和利用碳源的影响不大。

在反应器运行稳定的条件下，从3个阶段各选取一个典型周期进行分析，分别选第80天（第1阶段）、第140天（第2阶段）和第170天（第3阶段）的第2个周期作为典型周期，分析系统中PO₄^3-和COD的浓度变化，结果见图3。

由图3可知，系统典型周期的生物除磷能力受SRT的影响较大。反应器SRT分别为15、20、10 d时，典型周期内厌氧阶段末期释磷质量浓度由最初的34.03 mg/L降低到15.40 mg/L然后下降为12.51 mg/L，单位VSS比释磷速率由最初的0.24 mmol/（g·h）（以P计，下同）降到0.14 mmol/（g·h），最后下降为0.08 mmol/（g·h）。在好氧阶段，典型周期内好氧吸磷质量浓度由最初的48.45 mg/L降到27.72 mg/L然后下降为19.84 mg/L，PAOs快速吸收了系统中绝大多数的磷，表现出良好的吸磷性能；SRT=15 d时，厌氧-好氧除磷能力较好，系统出水PO₄^3-浓度最低；SRT提高到20 d时，厌氧释磷量减少，系统在好氧条件下PAOs吸磷速率较慢，系统出水PO₄^3-达到4.32 mg/L，系统的除磷能力变差；SRT=10 d时，系统对PO₄^3-的去除效果最差。较短的SRT意味着每天排出的剩余污泥量较多，这会使活性污泥中的PAOs随着时间的增长而越来越少，从而造成厌氧释磷量降低，吸磷能量减少，因此合理控制SRT对于EBPR系统保持良好的除磷性能很重要；同时，过度延长SRT会使系统内其他异养菌大量增殖，例如聚糖菌^〔14〕，其争夺营养物质的能力要强于聚磷微生物，系统中PAOs逐渐被取代，在一定程度上降低了除磷能力。

不同阶段的最终系统出水COD均小于50 mg/L，能够达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB 18918—2002）中一级A的排放标准。系统对COD的去除率始终能维持在85%以上，说明SRT的变化对COD的去除不会产生太大的影响，此SBR反应器中是一个复杂的活性污泥微生态系统，COD在不同SRT运行阶段都能被各种微生物吸收降解，因而能实现较高的去除效率。

厌氧阶段PAOs降解Ploy-P和Gly，释放PO₄^3-进入水体，同时为微生物摄取碳源提供能量，随后在好氧阶段，又重新合成Ploy-P和Gly。这符合强化生物除磷的代谢模式^〔15〕。考察反应器运行的3个阶段典型周期内PO₄^3-、Ploy-P和Gly的浓度变化，结果见图4。

由图4可知，当SRT=15 d时，系统中Ploy-P水解量为0.54 mmol/L，Gly分解量为0.57 mmol/L（以C计）；当SRT=20 d时，Ploy-P水解量为0.36 mmol/L，Gly分解量为3.90 mmol/L；当SRT=10 d时，Ploy-P水解量为0.22 mmol/L，Gly分解量为5.09 mmol/L。说明系统中微生物摄取碳源消耗的能量由Ploy-P水解和Gly分解来提供，随着有机碳源的减少，污水中的PO₄^3-浓度逐渐升高，完成厌氧释磷这一过程。在随后的好氧阶段，污泥样品中Ploy-P和Gly逐渐累积，系统表现出好氧过量吸磷的特性，从而实现从污水中除磷的目的。分析认为，当SRT从15 d延长为20 d时，系统中污泥停留时间偏长，强化了菌群的内源呼吸过程，这可能导致了PAOs释磷活性降低，从而Ploy-P水解量减少；另一方面，长SRT下系统排放的剩余污泥量减少，也导致了从系统排出的磷量减少，即系统除磷效率降低；调整SRT为10 d后，由于排放大量剩余污泥，使得系统中微生物量流失，PAOs数量减少，厌氧释磷遭到抑制，系统除磷性能恶化变差。因此，系统在SRT=15 d时，对于该系统内的PAOs生长和代谢较为适宜，除磷性能也较好。

采用16S rRNA高通量测序平台对EBPR系统中微生物多样性进行分析。在门的生物学分类水平上将样品序列进行分类。在整个系统的运行期间，一共鉴定出20个菌门。其中，SRT分别为15、20、10 d时分别鉴定出19、17、17个菌门。3个阶段稳定期在门生物学水平上的微生物群落结构见图5。

由图5可知，整个系统中Proteobacteria（变形菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Candidatus_Saccharibacteria为主要的菌门。SRT=15 d时，Proteobacteria占该阶段总的细菌数量的36%，为优势菌门，此外，Bacteroidetes、Candidatus_Saccharibacteria分别占总量的30%和11%，也属于优势菌门；SRT=20 d时，优势菌门也是Proteobacteria，占该阶段总量的45%，此外优势菌门也包括Bacteroidetes和Candidatus_Saccharibacteria；这就说明当SRT分别为15、20 d时，污泥中的优势菌门类型一致，只是各菌门所占比不同。当SRT=10 d时，优势菌门与前两阶段略有不同，Bacteroidetes的相对丰度最高，占该阶段细菌总数的38%。

变形菌门（Proteobacteria）是目前已知细菌中最大的一门，该门下的细菌大多都是既能进行呼吸代谢，又能进行发酵代谢的兼性异养菌，它们以有机物为碳源，是COD降解的主要参与者，这与之前的COD变化图一致。拟杆菌门（Bacteroidetes）是革兰氏阴性的厌氧菌，其通常作为水体粪便污染的指示细菌，拟杆菌门在分解大分子方面具有重要意义。

在系统运行的3个阶段，污泥样品中共检测出10种除磷功能菌属，其相对丰度对比见图6。这10个属的PAOs在3个阶段的分布情况：阶段1有10种、阶段2有10种、阶段3有9种。

由图6可知，该系统的除磷菌属分别是Rhodocyclus（红环菌属）、Tetrasphaera（四球虫属）、Aeromonas（气单胞菌属）、Brevundimonas（短波单胞菌属）、Dechloromonas（脱氯单胞菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、Acinetobacter（不动杆菌属）、Microlunatus（小月菌属）、Exiguobacterium（微小杆菌属）和Hydrogenophaga（氢噬菌属）。由图6还可知，Rhodocyclus在系统运行期间变化较小，呈现先降低后升高的趋势，在SRT=10 d时，其相对丰度最大（8%），说明该菌属更适合短SRT系统；污泥中还检测到Tetrasphaera，其相对丰度从第1阶段0.86%下降到第2阶段的0.53%，继而在第3阶段出现短暂的消失，由于该菌属的代谢机制仍未揭示，在本系统呈现的不规律变化还有待深究；Aeromonas的相对丰度在3个阶段中先上升再下降，当SRT=20 d时，其相对丰度达到最大，为1.03%，说明该均属的世代周期较长。研究结果表明，第1阶段中除磷功能菌属总相对丰度最大，相应地，该阶段系统除磷性能也最好。

（1）在低温（15 ℃）、以酪蛋白物为碳源的EBPR系统中，当SRT为15 d时，系统的除磷性能最优，除磷率可达95%；但是SRT的长短并没有影响微生物对有机物的去除，COD的去除率可达98%；

（2）在低温（15 ℃）、以酪蛋白水解物为碳源的EBPR系统中，当SRT为15 d时，系统的厌氧释磷质量浓度最大，为34.03 mg/L，好氧吸磷质量浓度也是最大，为48.45 mg/L，除磷效果最优；

（3）在本系统中，当SRT=15 d时，系统的生物多样性最高，PAOs总体相对丰度最高，该系统的优势菌门为Proteobacteria，优势菌属为Hydrogenophaga。