移动床生物膜反应器（MBBR）在20世纪90年代中期得到开发和应用^〔1〕，具有占地小、投资省、处理效率高、性能稳定、适应性强和运行管理简便等优点^〔2〕，是一种高效的生物脱氮工艺。近年来，为解决传统生物脱氮工艺中存在的能耗大、碳源投加量大、效率低等问题，短程硝化工艺成为研究热点^〔3-4〕。与传统的全程硝化工艺相比，短程硝化工艺可减少25%的硝化需氧量、40%的反硝化碳源、50%的污泥产量，以及反硝化池容积^〔5-6〕。采用MBBR实现短程硝化的快速启动及稳定运行，将为协同减污降碳的污水处理工艺提供更多选择。

短程硝化主要通过抑制亚硝酸盐氧化菌（NOB）的生长来实现亚硝酸盐氮（NO₂^--N）的积累，可通过控制酸碱度（pH）^〔7-8〕、游离氨（FA）^〔9-10〕、溶解氧（DO）^〔11-12〕、游离亚硝酸（FNA）^〔13-14〕及添加抑制剂^〔15-17〕等实现短程硝化的建立。目前，短程硝化启动时间长且运行不稳定，仍是城市污水实现自养脱氮的瓶颈。研究发现FNA处理活性污泥可选择性地抑制NOB并保留氨氧化菌（AOB）活性，是实现稳定短程硝化最简便有效且最有前景的技术之一^〔18-20〕。Huihui CUI 等^〔19〕通过高浓度FNA处理活性污泥32 d，成功启动短程硝化〔亚硝氮积累率（NAR）≥90%〕并实现了低温条件下的稳定运行。Cancan JIANG等^〔20〕采用FNA处理活性污泥18 h实现短程硝化的快速启动（NAR≥90%）。近年来，采用FNA预处理实现短程硝化的研究以活性污泥为主^{〔14，21-22〕}，FNA预处理在生物膜法中的应用研究鲜有报道。FNA预处理对生物膜工艺是否有效，在生物膜工艺中应用FNA预处理所需最佳浓度条件仍未可知。

笔者采用MBBR建立污水处理的硝化反应器，探讨采用FNA预处理建立稳定的MBBR-短程硝化工艺的可行性，评估不同FNA浓度下硝化细菌的活性和微生物群落变化，研究其对实现短程硝化稳定运行的影响。

圆柱形MBBR由有机玻璃制成，有效容积22 L。实验采用K3型鲍尔环悬浮填料，直径25 mm，填充比为30%。实验装置主要包括搅拌器、DO探头、pH探头、水质分析仪（德国WTW Multi 3420i）、微孔曝气扩散器、转子流量计、气泵等。MBBR每天运行2个周期，每个周期12 h，包括10 min进水、11.7 h曝气、10 min排水，排水比为70%。整个实验期间监测温度、pH和DO。实验装置见图1。

试剂：氯化铵（NH₄Cl，99.78%），天津渤化永利化工股份有限公司；醋酸钠（CH₃COONa，99.55%），连云港中鸿化工有限公司；CaCl₂（98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MgSO₄·7H₂O（分析纯）、KH₂PO₄（99.5%）、CuSO₄·5H₂O（分析纯）、MnCl₂·4H₂O（分析纯）、KI（分析纯）、Na₂MoO₄·2H₂O（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。FeCl₃·6H₂O（99%），上海麦克林生化科技有限公司；H₃BO₃（99.5%），天津市福晨化学试剂厂；ZnSO₄·7H₂O（99.5%）、CoCl₂·6H₂O（99%），天津市光复科技发展有限公司。

实验用水采用模拟生活污水（人工配水），以氯化铵和醋酸钠作为氮源和碳源。模拟生活污水的pH在7~8。人工配水成分见表1。

使用已成熟的全程硝化良好的生物膜，预处理前检测AOB和NOB活性，并取生物膜样品提取DNA。将已挂膜成熟且硝化性能良好的生物膜按填充比为30%均匀划分至6个相同的有效容积为1 L的MBBR中。用恒温槽维持温度在（25.0±0.5） ℃，用1.0 mol/L氢氧化钠溶液和1.0 mol/L盐酸溶液维持pH在5.0±0.1。添加亚硝酸钠至每个反应器，维持反应器内FNA质量浓度分别为0、3.2、6.4、9.6、12.8、16.0 mg/L（以NO₂^--N计），浸泡12 h进行预处理。对照组为未经FNA预处理生物膜（pH为7.0~7.5）。FNA质量浓度根据式（1）计算：

式中：ρNO2-——NaNO₂质量浓度，mg/L；

T——反应器内温度，℃；

pH——反应器pH。

待预处理结束后，分别测定各反应器中AOB和NOB活性，并取生物膜样品提取DNA。通过AOB和NOB活性分析及微生物菌群分析，评价预处理12 h时FNA浓度对污泥特性的影响，并确定FNA预处理最佳浓度。

在测定AOB和NOB活性之前，用去离子水将鲍尔环洗涤3次，以去除剩余的NH₄⁺-N、NO₂^--N和硝酸盐氮（NO₃^--N）。随后在1 L MBBR中加入NH₄Cl和NaNO₂，维持反应器初始NH₄⁺-N和NO₂^--N质量浓度均为30 mg/L。整个实验过程中，温度控制在（25.0±0.5） ℃，pH维持在7.0~7.5。同时，通过曝气泵提供充足的氧气（DO为6.0~7.0 mg/L）。每30 min取一次水样，共3 h。待反应结束后测定各水样中的NH₄⁺-N和NO₃^--N，作线性回归分析，对NH₄⁺-N去除率和NO₃^--N产率进行评价。以NH₄⁺-N去除率和NO₃^--N产率分别表征AOB和NOB的活性。FNA处理后生物膜活性的变化情况，通过处理前生物膜活性的占比表示。

聚合酶链式反应（PCR）扩增采用16S RNA基因V3和V4区域通用引物341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）。扩增反应体系（30 μL）包括2×Taq master Mix×15 μL，Bar-PCR primer F（10 μmol/L）1 μL，Primer R （10 μmol/L） 1 μL，Genomic DNA 10~20 ng，加H₂O至30 μL。扩增程序为95 ℃预变性3 min；94 ℃变性20 s、55 ℃延伸20 s、72 ℃延伸30 s，5个循环；再72 ℃延伸5 min。相同浓度的PCR产物进行等量混样，充分混合后使用琼脂凝胶电泳监测混合后的PCR产物，然后进行DNA纯化回收，利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，以方便按照1∶1的等量混合后测序。等量混合时，每个样品DNA量取10 ng，最终上机测序浓度为20 pmol/L。测序、序列拼接过滤及操作分类单元（OTUs）聚类均由上海生工科技有限公司完成。

为研究经FNA预处理后短程硝化的稳定性，采用实验确定的最佳FNA预处理浓度，对全程硝化性能稳定的生物膜进行FNA预处理。

稳定运行实验直接在MBBR中对生物膜进行预处理，预处理方法与批次实验相同，预处理结束后继续维持MBBR正常运行。实验仅对生物膜进行1次FNA预处理，实验为期50 d。实验期间，每天测定1次MBBR进水和出水中的NH₄⁺-N、NO₂^--N和NO₃^--N。

NH₄⁺-N——纳氏试剂分光光度法；NO₂^--N——N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法；NO₃^--N——麝香草酚分光光度法；DO、pH和温度采用Multi 3420i在线探头检测（德国WTW）。MLSS、MLVSS——超声波（45 kHz，120 W，2~3 min）剥落生物膜，离心（10 000 g，15 min），后采用重量法测定。

NAR和氨氮去除率（ARR）分别按照式（2）、式（3）计算：

式中：Δ(NO2-)——进出水中NO₂^--N的质量浓度差，mg/L；

Δ(NO3-)——进出水中NO₃^--N的质量浓度差，mg/L；

NH4+-Ninf——进水NH₄⁺-N质量浓度，mg/L；

NH4+-Neff——出水NH₄⁺-N质量浓度，mg/L。

实验以ARR达到60%作为硝化性能良好的评价指标，采用NAR达到80%作为评价短程硝化启动成功、稳定运行和破坏修复效果的指标^〔23〕。

为了确定FNA预处理生物膜建立短程硝化反应的最佳条件，测定不同FNA浓度预处理生物膜12 h时AOB和NOB的活性变化，结果见图2。

由图2可知，FNA浓度增加导致AOB和NOB的活性普遍降低，而在相同浓度下，FNA对NOB的抑制作用大于对AOB的抑制作用。当FNA预处理质量浓度为6.4 mg/L时，AOB活性为66.34%，NOB活性仅为28.67%。NOB比AOB更为敏感，这一结果与前人研究一致^〔24〕。在FNA为9.6 mg/L条件下预处理12 h后，AOB活性保持在52.27%，而NOB活性降至22.20%。

AOB和NOB的丰度是反映短程硝化成功建立的关键指标。采用qPCR对不同质量浓度FNA预处理的AOB（amoA）和NOB组（Nitrospira和Nitrobacter）的丰度进行定量分析，结果见图3。

由图3可见，AOB在硝化菌群中占主导地位，而NOB菌群中占主导地位的是Nitrospira不是Nitrobacter，这与此前的报道一致^〔25-26〕。AOB和NOB的丰度均随FNA质量浓度的增加而降低，但FNA对NOB的影响较AOB更显著，与FNA对AOB和NOB活性的影响相似。经FNA（6.4 mg/L HNO₂-N）处理12 h后，AOB数量降到2.68×10⁸ g^-1（以MLSS计），比未处理的污泥减少了30.39%。在相同条件下NOB数量降到2.01×10⁶ g^-1（以MLSS计），比未处理的污泥减少64.42%。NOB种群数量与活性之间存在显著正相关，结合2.1结果可知，NOB活性降低更可能是失活的原因，而不是抑制的原因。

为考察FNA预处理对活性污泥中细菌群落结构的影响，进行高通量测序分析。利用MiSeq高通量测序平台共读出241 738~359 690条有效序列，且所有样品的覆盖率均达到99.6%以上，说明样品的测序深度合适，所得数据能够很好地反映环境中微生物群落结构的真实信息。基于标准化OTU计算 α 多样性指数，包括Ace、Chao1、Simpson和Shannon指数（见表2），以评估FNA浓度对微生物丰富度和多样性的影响。其中，Ace和Chao指数表征样品的群落丰富度，Simpson和Shannon指数反映样品的多样性和均匀度。

从表2可见，由Simpson和Shannon指数得到的各样品物种多样性关系与接种污泥相比均有所减少。添加FNA进行预处理的微生物多样性与未添加FNA进行预处理的相比，随着FNA浓度的增加，微生物多样性呈现先增加后减少的趋势，而微生物丰富度一直在减少。该结果与以往FNA预处理后活性污泥细菌多样性会增加的研究结果不一致^〔20〕。可能是因为处理微生物的性状不同，生物膜与活性污泥相比具有一定厚度，传质作用导致FNA对生物膜内部的影响缓慢，从而使得所需FNA浓度较大。

为了解FNA对特定微生物种群的影响，对微生物群落的变化作进一步评价。图4为各样品在科水平上微生物的种群结构，共总结了相对丰度较高的前11个分类类别，未分类的序列被标记为“Others”。

由图4可知，接种污泥和FNA预处理后污泥中的微生物群落均以Rhodocyclaceae为主，占细菌总序列的13.21%～40.01%。据报道，在污水处理系统中发现的Rhodocyclaceae大多数都是反硝化菌，且可利用亚硝酸盐作为电子受体^〔27〕。本研究中FNA处理后生物膜的Rhodocyclaceae均比接种生物膜（Y0）的相对丰度少，由Y0中的40.01%降至F0中的13.21%，但仍为优势菌属。这可能是由于所选取的FNA浓度较高，反硝化菌虽然可利用亚硝酸盐作为电子受体，但过高浓度的FNA会抑制Rhodocyclaceae的生长。预处理后污泥的其他优势菌与前人研究发现的优势菌科^{〔20， 28-29〕}一致，分别为Xanthomonadaceae^〔20〕、Rhodobacteraceae^〔26〕、Acidobacteria^〔28〕和Cytophagales_unclassified，其相对丰度分别稳定在13.77%、4.70%、4.00%、3.18%左右。FNA处理活性污泥后，可观察到特定科水平的变化，但微生物群落并没有发生明显的变化。此外，Comamonadaceae、Saprospiraceae、Planctomycetaceae和Chitinophagaceae菌科的变化趋势相同，均随FNA的增加而先增加后减少。这说明适量的FNA可促进微生物的生长和繁殖，但过量的FNA会导致部分微生物不适应环境而被淘汰。

科水平上变化最明显的是Nitrospiraceae（NOB的一种），相对丰度从Y0的1.39%降至F0的0.92%；此后随FNA增加至6.4 mg/L，其相对丰度降至0.19%，FNA质量浓度增至16.0 mg/L时相对丰度降至0.06%。Nitrosomonadaceae是AOB菌的一种，其相对丰度与Nitrospiraceae相比变化较小。随着FNA从0增至6.4 mg/L，Nitrosomonadaceae的相对丰度从1.79%降至1.32%；FNA继续增至16.0 mg/L，Nitrosomonadaceae的相对丰度从1.32%降至0.11%。在科水平上，当FNA由0增加至6.4 mg/L时，NOB受到的影响比AOB大；当FNA由6.4 mg/L增加至16.0 mg/L时，FNA对AOB的影响比对NOB的影响更大。

属水平上微生物的群落结构见图5。

由图5可知，Nitrosomonas （AOB）初始相对丰度为0.92%。随着FNA的提高，Nitrosomonas在F2（6.4 mg/L）和F5（16.0 mg/L）中的相对丰度降低至0.78%和0.39%。在接种生物膜中，NOB由Nitrobacter和Nitrospira组成，其相对丰度分别为0.16%和0.32%。随着FNA的增加，Nitrobacter和Nitrospira在F2（6.4 mg/L）中相对丰度分别降至0.1%和0.09%；当FNA质量浓度升至16.0 mg/L时（F5），Nitrobacter和Nitrospira最终降至0.07%和0.02%。随着FNA质量浓度的提高，Nitrobacter成为NOB的主要菌属，这是因为Nitrobacter是一种r型细菌，它在高NO₂^--N环境下更有优势。Nitrobacter在硝态菌群中占主导地位时，可以抑制Nitrospira的生长，提高短程硝化的稳定性^〔30〕。在属水平上，当FNA质量浓度由0增加至6.4 mg/L时，NOB的相对丰度降幅比AOB的更大，当FNA质量浓度由6.4 mg/L增加至16.0 mg/L时，FNA对AOB的影响比对NOB的影响更大。

由活性实验、qPCR和高通量结果分析可知，当FNA质量浓度为6.4 mg/L时，可有效减少NOB的丰度和活性，并维持AOB的活性。FNA质量浓度由6.4 mg/L增加至16.0 mg/L时，FNA对AOB的影响比对NOB的影响更大，且FNA质量浓度为9.6 mg/L和12.8 mg/L时预处理后的效果相似。当FNA质量浓度为16.0 mg/L时，NOB的活性几乎为0，但AOB的活性也不足50%，NH₄⁺-N去除效果差。因此，考虑到脱氮效果及经济成本，实验选择FNA质量浓度为6.4 mg/L为预处理的最佳条件。

已有研究表明，FNA完全抑制NOB和AOB生长的质量浓度分别为0.02 mg/L和0.4 mg/L^〔31〕。实验所选取的FNA质量浓度远高于此值，且与普通活性污泥法采用的FNA相比也较高。Cancan JIANG等^〔20〕采用1.8 mg/L FNA预处理活性污泥成功实现短程硝化，本实验选取的FNA质量浓度为6.4 mg/L，是普通活性污泥法的3倍多。预处理时间可能是导致FNA浓度差别的原因，处理时间越短所需要的FNA浓度越大。此外处理微生物的性状不同可能是另一原因，生物膜与活性污泥相比具有一定的厚度，传质的影响导致FNA对生物膜内部影响作用缓慢，从而使所需的FNA浓度增大。

在污水处理中，对NOB的长期有效抑制是实现短程硝化稳定运行的关键。为探究FNA预处理生物膜实现的短程硝化能否稳定运行，进行了为期50 d的实验研究。为维持反应器中足够的氧基质浓度，并使鲍尔环能够保持良好的移动效果，控制反应器中DO质量浓度为6.0 mg/L。反应器硝化性能的变化情况见图6。

图6中，第1~10 天，反应器出水NH₄⁺-N和NO₂^--N几乎为0，出水NO₃^--N高达（45±5） mg/L，全程硝化性能良好。在第11 天时，对全程硝化生物膜浸泡12 h进行预处理，预处理FNA质量浓度为6.4 mg/L。生物膜经FNA预处理后NAR迅速升高至80%以上并保持稳定，出水NO₃^--N下降，至第13 天出水NO₃^--N降至（5±3） mg/L，出水NO₂^--N升高至（30±5） mg/L并保持稳定。

实验结果表明，经FNA预处理后成功实现了短程硝化的启动和稳定运行。已有短程硝化启动相关研究结果中，Jia LI等^〔15〕通过连续13 d添加5 g/L NH₂OH成功启动短程硝化，NAR稳定维持在90%以上。Jipeng WANG等^〔16〕通过添加30 mmol/L甲醇23 d，使得NAR高达90%以上并稳定运行50 d。与添加抑制剂相比，通过FNA预处理实现短程硝化具有处理时间和启动时间短等特点，更具工程应用性。

在实验第9、12、50 天的典型周期内，对各基质浓度的变化情况进行沿程测试，结果见图7。

由图7可知，第9 天运行周期结束时，出水NH₄⁺-N、NO₂^--N、NO₃^--N分别为6.08、3.25、35.56 mg/L，生物膜全程硝化性能良好。COD在周期开始3 h内几乎被分解完全，出水COD为50 mg/L左右。第12 天典型周期内，出水NO₂^--N浓度升高。在进水水质相同的条件下，至反应周期结束，出水NH₄⁺-N、NO₂^--N、NO₃^--N的质量浓度分别为17.57、28.19、2.91 mg/L。COD在3 h内几乎被分解完全，出水COD为60 mg/L左右。实验运行第50 天时，在整个运行周期生物膜仍保持良好的短程硝化性能。至运行周期结束，NH₄⁺-N、NO₂^--N、NO₃^--N的质量浓度分别为7.73、32.64、3.2 mg/L，COD为47 mg/L左右。

图7中，第9天时生物膜全程硝化性能良好，至运行的第10 小时，进水NH₄⁺-N几乎全部被氧化为NO₃^--N，表明AOB、NOB活性较好。第12 天时，生物膜经FNA处理后，NOB活性下降，出水NO₂^--N浓度升高。运行周期末，NH₄⁺-N浓度与全程硝化时的出水NH₄⁺-N浓度相比略有提高。FNA在抑制NOB活性的同时，对AOB也产生了一定的抑制作用^〔32〕。反应器运行至第50 天时，进水NH₄⁺-N几乎全部被氧化为NO₂^--N，出水几乎无NO₃^--N产生，NAR高达90%。实验结果表明生物膜经FNA处理后，NOB活性显著降低，成功实现了短程硝化的启动。实验表明采用适量的FNA处理生物膜后，亚硝化性能显著降低，成功实现了MBBR-短程硝化工艺的启动和稳定运行。

许多因素已被证明有助于短程硝化的启动。杨庆等^〔33〕研究认为通过将DO控制在0.5 mg/L条件下可实现亚硝酸盐的大量积累。彭永臻等^〔34〕研究发现pH是污水处理中抑制NOB活性的一个重要参数。当pH在8.0以上时，可以实现亚硝氮的积累。然而本实验是在中性（pH为7.0~7.5）、高DO（DO为6.0 mg/L）条件下进行的，说明启动短程硝化的主要原因是FNA预处理降低NOB的数量，使NOB活性降低。由此可知，通过应用适宜浓度的FNA处理生物膜，选择性地抑制NOB的活性来实现短程硝化的启动和稳定运行是可行的。

研究了FNA预处理生物膜建立短程硝化的可行性、最佳条件及其对生物膜微生物群落的影响，评估了FNA预处理对所建立短程硝化稳定性的影响。

（1）FNA预处理时间为12 h时，实现MBBR-短程硝化工艺的最佳FNA质量浓度为6.4 mg/L，处理后NOB活性降至28.67%，AOB活性为66.34%。在最佳FNA处理条件下预处理后可以有效减少NOB的丰度，从而实现MBBR-短程硝化工艺的启动和稳定运行。

（2）适量的FNA可促进微生物的生长和繁殖，但过量的FNA会导致部分微生物不适应环境而被淘汰。FNA预处理对NOB的影响大于对AOB的影响，当FNA质量浓度由0增至6.4 mg/L时，NOB的相对丰度降幅比AOB的大；当FNA质量浓度由6.4 mg/L增至16.0 mg/L时，FNA对AOB的影响比对NOB的影响更大。

（3）生物膜经 FNA处理1次后，NAR即可达到 85%以上，且 MBBR-短程硝化工艺在常温和高DO条件下可以稳定运行40 d。