印染废水具有水量大、有机污染物含量高、色度高、碱性大、盐度高、水质变化大等特点^〔1〕。毛用活性染料由于其重金属离子残量对人体和环境的影响较小，逐渐取代了用于羊毛和聚酰胺纤维染色的酸性含媒染料^〔2〕。但是其发色团中的偶氮母体会对水生生态系统产生毒性^〔3〕，还会抑制光合作用，对环境造成严重污染^〔4〕。此外，这些染料及其芳香胺降解产物会对人类和动物产生致癌、致畸和诱变等不利的影响^〔5〕。因此，如何有效地去除废水中的这些染料已成为亟需解决的问题。

目前，含偶氮发色团染料废水的处理主要是通过理化和生物工艺进行的。但理化处理仍存在材料成本高、产生的二次废物比含偶氮染料更有害等缺点^〔6-7〕，而生物修复是一种生态友好、廉价、有效的处理方法，引起了人们的广泛关注。目前，微生物降解含偶氮发色团染料的研究主要采用厌氧-好氧工艺。微生物先吸附和富集染料分子，在厌氧条件下破坏其不饱和键及发色基团促进染料脱色，产生有致癌性质的无色芳香胺，对环境产生更大的危害。这些芳香胺接着通过好氧过程进行脱氨氧化，最终降解成简单无机物或转化为各种代谢中间体^{〔5, 8〕}。因此，筛选出能对染料进行高效彻底脱色和降解的微生物具有重要的理论和实用价值。

本研究以毛用活性红染料PW-6g为筛选底物，从土壤中分离出1株具有高活性偶氮染料降解脱色酶系的细菌。进一步对该菌株的脱色性能进行了研究，并利用高效液相色谱法对染料脱色代谢产物进行了分析，验证了染料的微生物脱色代谢过程，以期为工业化生物处理印染废水提供参考和依据。

供试土样采自海南东寨港红树林自然保护区浅滩土壤；毛用活性红PW-6g购自天津德凯化工股份有限公司。

（1）富集培养基。PW-6g 0.2 g，NH₄NO₃ 4.0 g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g，KH₂PO₄ 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.3 g，微量元素溶液1 mL，加水至1 000 mL，调pH至7.0。微量元素溶液配方：FeSO₄·7H₂O 0.5 g，MnSO₄·H₂O 0.15 g，ZnSO₄ 0.14 g，无水CaCl₂ 0.1 g，加水至1 000 mL。

（2）富集固体培养基。在富集培养基的基础上添加2%的琼脂。

（3）增殖培养基。牛肉膏3.0 g，葡萄糖5.0 g，蛋白胨2.0 g，KH₂PO₄ 1.8 g，NaH₂PO₄ 3.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.03 g，MnSO₄·H₂O 0.02 g，MgSO₄·7H₂O 0.20 g，ZnSO₄ 0.05 g，无水CaCl₂ 0.01 g，加水至1 000 mL，调pH至7.0。

（4）增殖固体培养基。在富集培养基的基础上添加2%的琼脂。

（5）脱色降解培养基。在富集培养基的基础上添加一定量的毛用活性红PW-6g。

取5.0 g供试土样加入到含10 mL富集培养基（PW-6g质量浓度为50 mg/L）的250 mL锥形瓶中，30 ℃、150 r/min富集振荡培养，7 d后接种5 mL培养液到含PW-6g的富集培养基中（染料浓度成倍增大），培养4个周期使PW-6g最终质量浓度达到400 mg/L。以划线法接种第4次富集的培养液（PW-6g质量浓度为400 mg/L）于含400 mg/L PW-6g的富集固体培养基上，30 ℃下培养2 d，分离得到单菌落。经培养获得4株在高浓度PW-6g为唯一碳源的富集固体培养基平板上能生长的细菌。将其多次划线纯化后保存于增殖固体培养基斜面上。

将4株菌分别培养在含有400 mg/L PW-4 g的增殖培养基中，在30 ℃下培养24 h（pH为7.0），8 000 r/min离心分离15 min。上清液用于胞外酶活测定。沉淀细胞重悬于pH为7.2的0.1 mol/L磷酸缓冲盐溶液中进行超声处理，在4 ℃下超声10次，每次20 s，每次超声间隔10 s，功率为200W。然后将细胞破碎液再次离心，取上清液用于胞内酶活测定。

（1）偶氮还原酶（AZOR）。通过监测482 nm吸光度的减少量来计算AZOR酶活。1 mL反应体系：0.1 mol/L磷酸缓冲盐溶液（pH为7.0），1 mmol/L NADH，24 μmol/L橙黄Ⅱ，10 μL酶液。1个酶活力单位定义为每min还原1 μmol橙黄Ⅱ所需的酶量。

（2）苯胺双加氧酶（ADO）。通过监测氧消耗的量来计算胞内ADO酶活。取离心后的细胞沉淀，细胞重悬于10 mmol/L磷酸缓冲盐溶液（pH为7.0）中，制得细胞悬液。1 mL反应体系：预先氧饱和的10 mmol/L磷酸缓冲盐溶液（pH为7.0），1 mmol/L苯胺，1 mL细胞悬液。以不加苯胺的反应体系测定细胞本底呼吸。测定结束后，将反应液收集，反复离心洗涤3次后，烘干至恒重，计算细胞干重。1个酶活力单位定义为每min氧化苯胺消耗1 mg O₂所需的细胞量。

（3）苯甲酸-1，2-双加氧酶（B12O）。通过监测340 nm吸光度的减少计算B12O酶活。1 mL反应体系：0.1 mol/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲盐溶液（pH为6.7），1 mmol/L苯甲酸钠，0.13 mmol/L NADH，10 μL酶液。1个酶活力单位定义为每min氧化1 μmol NADH所需的酶量。

（4）邻苯二酚-1，2-双加氧酶（C12O）。通过监测260 nm吸光度的增加计算C12O酶活。1 mL反应体系：8.7 mmol/L酒石酸缓冲盐溶液（pH为7.0），1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L邻苯二酚，10 μL酶液。1个酶活力单位定义为每min产生1 μmol己二烯二酸所需的酶量。

（5）邻苯二酚-2，3-双加氧酶（C23O）。通过监测375 nm吸光度的增加计算C23O酶活。1 mL反应体系：48 mmol/L酒石酸缓冲盐溶液（pH为7.5），1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L邻苯二酚，10 μL酶液。1个酶活力单位定义为每min产生1 μmol 2-羟基己二烯半醛酸所需的酶量。

（6）蛋白含量测定。以牛血清白蛋白为标准蛋白采用Lowry法测定蛋白浓度。

对菌株Mab_hk-3的16S rDNA序列测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。将菌株的16S rDNA序列在NCBI中与相关的16S rDNA序列进行同源性比较，在16S rDNA序列分析的基础上，采用MEGA程序构建系统发育树。

接种菌株Mab_hk-3放至增殖培养基中，30 ℃、150 r/min振荡培养16 h，细胞浓度约为4.0×10⁸CFU/mL。按5%（体积分数，下同）的量接种菌悬液至含200 mL脱色降解培养基（PW-6g质量浓度为400 mg/L）的500 mL锥形瓶中，30 ℃、150 r/min振荡培养48 h。将培养液于5 000 r/min离心15 min，上清液于PW-6 g的最大吸收波长498 nm下测定其吸光度A₁，以不接菌悬液的脱色降解培养基的吸光度A₂为对照，计算脱色率。

（1）PW-6g质量浓度对脱色率的影响。按5%的量将菌悬液接入PW-6g初始质量浓度分别为100、200、300、400、500、600、700 mg/L的200 mL脱色降解培养基中，在30 ℃、转速为150 r/min的摇床中培养脱色48 h，测定吸光度并计算脱色率。

（2）温度对脱色率的影响。按5%的量将菌悬液分别接入含400 mg/L PW-6g的200 mL脱色降解培养基中，置于温度分别为20、25、30、35、40、45、50 ℃，转速为150 r/min的摇床中培养脱色48 h，测定并计算脱色率。

（3）pH对脱色率的影响。按5%的量将菌悬液分别接入pH分别为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5含400 mg/L PW-6g的200 mL脱色降解培养基中，在30 ℃、转速为150 r/min的摇床中培养脱色48 h，测定吸光度并计算脱色率。

（4）接种量对脱色率的影响。按2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的量将菌悬液分别接入pH为7.0的含400 mg/L PW-6g的200 mL脱色降解培养基中，在30 ℃、转速为150 r/min的摇床中培养脱色48 h，测定吸光度并计算脱色率。

（5）盐浓度对脱色率的影响。按5%的量将菌悬液分别接入pH为7.0的含400 mg/L PW-6 g的200 mL脱色降解培养基中（NaCl质量浓度为0、10、20、30、40、50 g/L），在30 ℃、转速为150 r/min的摇床中培养脱色48 h，测定吸光度并计算脱色率。

取最适脱色条件下经48 h脱色的脱色液100 mL经10 000 r/min离心10 min，取上清液，进行HPLC分析。分析条件：色谱柱为月旭科技（上海）股份有限公司生产的Ultimate^®AQ-C18，5 μm，4.6×250 mm；流动相:V（甲醇）:V（20 mmol/L乙酸铵溶液）=5:95；流速为1.0 mL/min；柱温为25 ℃；检测波长为254 nm。

从红树林土壤中分离到4株能以毛用活性染料PW-6g为唯一碳源的脱色细菌菌株。经纯培养后，对其AZOR、ADO、B12O、C12O、C23O的酶活性进行测定，结果见表1。

由表1可知，4株菌经24 h的脱色诱导，均呈现较强的胞内偶氮还原酶活力。其中，Mab_hk-3的AZOR活力最强。经PW-6g诱导后，Mab_hk-3的ADO活性最强，比对照组提高了132%；Mab_hk-1和Mab_hk-3的B12O活性显著增加，分别提高了181%和141%；Mab_hk-3和Mab_hk-4的C23O活性也显著增加，分别提高了133%和167%；Mab_hk-2和Mab_hk-3的C23O活性也显著增加，分别提高了66%和227%。而且，PW-6g能够促进B12O、C12O、C23O向胞外释放，因此在胞外也检测到较强的酶活性。

由毛用活性红PW-6g分子结构^〔9〕可知，PW-6g的降解始于偶氮键的断裂，且在降解过程中会产生有毒的苯胺类化合物。因此，AZOR和ADO的活性对PW-6g的降解尤为重要。综合酶活性结果，Mab_hk-3在PW-6g诱导下具有较强的PW-6g降解能力。

Mab_hk-3的16S rDNA碱基长度为896碱基对（bp）。将Mab_hk-3的16S rDNA测序结果与GenBank中现有的菌种16S rDNA基因序列进行比对，发现Mab_hk-3与多株芽孢杆菌16S rDNA核苷酸序列的同源性较高，均达到99%以上，依据此结果，Mab_hk-3可归属于芽孢杆菌纲芽孢杆菌目芽孢杆菌属。选择BLAST比对结果中相似度最高的11条16S rDNA，利用MEGA 7.0软件进行多重序列比对绘制菌株系统发育树，结果见图1。

由图1可知，Mab_hk-3与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis UHSBs02B）同源性最高，且位于同一个分支上，故暂将该菌株命名为Bacillus subtilis Mab_hk-3。

考察PW-6g初始质量浓度对脱色率的影响，结果见图2。

由图2可知，PW-6g初始质量浓度为100~600 mg/L时，菌株Mab_hk-3 48 h的脱色率均达到97.0%以上，脱色液几乎无色，离心沉淀菌体为白色，说明菌株Mab_hk-3能耐受较高浓度的PW-6g染料。PW-6g初始质量浓度达到700 mg/L时，脱色率显著降低且菌体量较少，呈深红色。结果表明，染料达到一定浓度后，一方面其毒性增强，超出了菌株的代谢阈值，影响了菌株的生长，使得菌株对染料的降解能力下降；另一方面菌体吸附了染料达到饱和，菌体周围的染料浓度过大，染料的毒性蓄积在细胞表面，影响了细胞膜的功能，导致降解率下降。结果显示，当PW-6g初始质量浓度超过600 mg/L时，采用Mab_hk-3菌株进行脱色降解，需要对染料废水进行适度稀释。

考察温度对脱色率的影响，结果见图3。

由图3可知，温度低于35 ℃时，随着温度的增加，菌株Mab_hk-3对PW-6g的48 h脱色率增加，30~35 ℃时的脱色率最大，对PW-6g的脱色率接近100%；当温度大于35 ℃时，随着温度升高，脱色率下降，50 ℃时对PW-6g的脱色率仅有13%左右。这是因为35 ℃以下，温度的升高有利于细菌的生长和细胞内的酶促反应，从而利于对PW-6g的吸附降解，但温度太高，引起细菌快速的老化衰退，温度高于细胞内的酶促反应的最适温度，从而使细菌对PW-6g的吸附降解能力下降。

染料分子及代谢产物均为兼性分子，其解离状态随脱色液中pH的变化而改变，直接影响PW-6g的吸附降解，考察pH对脱色率的影响，结果见图4。

由图4可知，当pH低于7.5时，Mab_hk-3菌株对PW-6g的脱色率随pH的升高而升高；当pH高于7.5时，脱色率随pH的升高而下降；当pH为6.5~7.5时，有最佳脱色效果，对PW-6g的12 h脱色率已经大于80%，48 h脱色率接近100%。还可以看出，pH分别为3.5、8.5时对PW-6g的48 h脱色率也大于50%，说明菌株Mab_hk-3对PW-6g脱色时，有一定的pH适应范围。然而，在较碱性的pH条件（pH=9.5）下培养48 h后，脱色效率显著降低至22%，明显低于相对强酸性pH条件（pH=3.5）。因此，在利用Mab_hk-3菌株对含PW-6g染料废水进行脱色时，应确保废水pH不超过8.5。

考察接种量对脱色率的影响，结果见图5。

从图5可知，接种量为2%时，Mab_hk-3菌株对PW-6g的48 h脱色率最低，仅有59%左右；随着接种量加大，脱色率逐渐增加，接种量为4%~8%时，脱色率最大，Mab_hk-3对PW-6g的脱色率均接近100%。且当接种量大于4%时，脱色过程非常稳定，过大的接种量不会显著影响PW-6g的脱色降解。从考虑成本和微生物生长繁殖等角度出发，选接种量为4%比较合适。

由于活性染料废水中通常含有高浓度的盐，而这些盐能够影响微生物的生长和代谢，因此研究脱色菌Mab_hk-3对盐的耐受性至关重要。基于上述考虑，考察盐质量浓度对PW-6g脱色率的影响，结果见图6。

由图6可知，脱色24 h时，NaCl质量浓度为0~40 g/L时，PW-6 g的脱色率可达80%以上。当盐质量浓度增加到50 g/L时，PW-6g的24 h脱色率低于70%。这说明盐浓度的增加对脱色过程有负面影响。但随着脱色时间的延长，脱色率进一步提高，在高盐质量浓度（50 g/L）脱色48 h后，脱色率达81%以上。结果表明，Mab_hk-3脱色菌能耐受质量浓度为40~50 g/L的盐，显示出巨大的工业应用潜力。

根据文献〔6-7, 10-12〕报道的与PW-6g结构相似的染料的降解途径，推测毛用活性红染料PW-6g的降解途径如下：首先PW-6g经AZOR和酰胺酶降解，经脱溴、脱磺酸基、偶氮键断裂、酰胺键断裂，生成对苯二胺、1，2-二氨基-8-萘酚、苯甲酸等。1，2-二氨基-8萘酚可继续降解为邻苯二甲酸并进入苯甲酸代谢途径。而对苯二胺可降解为苯胺，再通过ADO、C12O、C23O进一步降解开环形成4-羟基-2-酮戊酸，最终进入中心碳代谢，用作为细菌生长的碳源。

按接种量为4%的量接种4株菌的菌悬液至含200 mL脱色降解培养基（PW-6g质量浓度为600 mg/L，pH为7.5）的500 mL锥形瓶中，35 ℃、150 r/min振荡培养48 h。利用HPLC分析脱色液中的主要代谢产物，结果见表2。

由表2可知，经4株菌48 h脱色后主要代谢产物均显著下降。特别是Mab_hk-3，脱色液中主要污染物PW-6g、对苯二胺、苯胺、邻苯二甲酸、苯甲酸和邻苯二酚经脱色后，均检测不出。说明Mab_hk-3对PW-6g具有高效彻底的脱色降解能力。

（1）通过梯度驯化和酶活检测，筛选出1株能高效利用毛用活性红染料PW-6g的菌株，并通过16S rDNA鉴定为Bacillus subtilis spp.。

（2）Mab_hk-3菌株的最佳脱色降解PW-6g的条件：PW-6g的初始质量浓度为600 mg/L、pH为7.5、温度为35 ℃、接种量为4%、盐质量浓度小于40 g/L。在该条件下，接种菌株Mab_hk-3脱色48 h对PW-6g的脱色降解率可接近100%。

（3）通过HPLC分析验证了微生物降解PW-6g的代谢途径。PW-6g是通过偶氮键断裂、脱磺酸基、脱氨、多步氧化及开环最终进入中心碳代谢，用作为细菌生长的碳源。