近年来，随着全球抗生素产量和使用量的快速增长^〔1〕，一些未被利用的抗生素随污水排入了自然水体。虽然目前水体中抗生素浓度不高，但是抗生素的长期存在会使微生物产生耐药性，对于水生生物、动物及人类存在潜在风险^〔2〕。四环素类抗生素作为全球生产和使用最多的抗生素之一，已经被广泛应用于医药、畜牧和水产养殖等行业^〔3〕。四环素生产过程中产生的废水的有效处理对减轻环境污染至关重要，废水的不当处置会导致四环素及其合成过程中的化合物进入自然水体，从而会诱导水中微生物产生抗性基因^〔3〕。

生物法是水处理领域应用最为广泛的技术，其主要有活性污泥和生物膜两种工艺^〔4〕。目前，活性污泥和生物膜法都被广泛应用于四环素废水的处理^〔5-6〕。但是，由于四环素具有难生物降解和高生物毒性的特点^〔3〕，四环素废水处理具有相当大难度。同时，四环素会导致水中微生物产生抗生素抗性^〔7〕，具有四环素抗性的微生物在污染物的去除过程中发挥重要作用，但是微生物抗性的增加也在一定程度上给人类健康带来了潜在的生物风险。已有研究表明微生物群落结构是影响抗生素抗性基因的重要因素^〔8-9〕，且活性污泥和生物膜的微生物组成有着明显差异^〔10-11〕，但是，关于活性污泥和生物膜中抗性基因差异尚未见报道。

本研究以序批式反应器(SBR)和移动床生物膜反应器(MBBR)两种类型的生物反应器为研究对象，探究了不同四环素浓度条件下活性污泥和生物膜工艺对四环素废水中污染物去除的影响。同时，比较了活性污泥和生物膜中ARGs组成差异，从ARGs的角度分析了两种工艺对四环素废水中污染物去除存在差异的原因。此外，还对活性污泥和生物膜中ARGs存在的差异进行了解析，揭示了造成两种工艺中ARGs差异的主要原因。

本研究共运行了4个反应器，分别是2个序批式反应器(Control-SBR、SBR)和2个膜生物反应器(Control-MBBR和MBBR)，其中Control-SBR和Con- trol-MBBR为对照组。反应器有效容积均为2 L，进水采用人工配水，碳源为葡萄糖和四环素，以氯化铵、磷酸二氢钾分别作为氮源和磷源，其水质条件见表 1。其它微量元素包括：89 mg/L MgSO₄·7H₂O，27 mg/L CaCl₂·2H₂O，24 mg/L FeSO₄·7H₂O，34 mg/L ZnSO₄·7H₂O，250 mg/L MnCl₂·4H₂O，6 mg/L(NH₄)₆ Mo₇O₂₄· 4H₂O，8 mg/L CuSO₄·5H₂O和8 mg/L CoCl₂·6H₂O。序批式反应器和膜生物反应器的水力停留时间(HRT)均为8 h，其中序批式反应器的进水、曝气、静置、排水时间分别为5、440、30、5 min，曝气条件下反应器中溶解氧(DO)都维持在2~4 mg/L，膜生物反应器中填料的填充比为50%。每天对反应器的进、出水进行取样，经过0.45 μm滤膜过滤后进行氨氮(NH₄+-N)、总氮(TN)、COD和四环素浓度的测定^〔12〕。通过测定悬浮固体浓度(MLSS)来反映反应器中的生物量^〔12〕，在对膜生物反应器中MLSS的测量之前对填料上附着微生物进行洗脱。

采集反应器中的污泥和生物膜样品储存于离心管中，离心(5 000 xg，5 min)后去除上清液，并加入50%乙醇(体积分数)进行固定，将装有样品的离心管放于-20 ℃冰箱储存。样品采用DNA提取试剂盒(FastDNA SPIN Kit for Soil，MP Biomedicals，USA)进行DNA的提取，提取的DNA存放于-80 ℃冰箱，用于后续的高通量测序。

对提取的DNA进行PCR扩增用于后续的16S rRNA基因组测序，PCR扩增采用的引物为515F (5’-GTG CCA GCM GCC GCG GTA-3’)和806R(5'- GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’)。PCR反应体系为20 μL，包括4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL正向引物(5 μmol/L)，0.8 μL反向引物(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu DNA聚合酶和10 ng DNA模板。PCR反应条件为：95 ℃ 3 min，95 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循环27次，然后在72 ℃下维持10 min。PCR扩增产物用于后续建库，利用MiSeq平台(San Diego，CA，USA)进行16S rRNA基因测序。此外，我们将提取的DNA随机打断为350 bp的片段，用于后续的宏基因组文库制备。将DNA文库的浓度稀释到2 ng/μL，为保证文库的质量，使用qPCR准确定量文库浓度。建好的文库在Illumina HiSeq 4000(San Diego，CA，USA)平台进行双端测序(2×150 bp)。

采用QIIME^〔13〕软件去除16S rRNA基因测序得到的低质量序列并对正向和反向序列进行拼接。同时采用该软件对质控后的序列进行了操作分类单元(OTU)的划分(97%)和alpha多样性的计算，并利用Greengenes数据库对OTU的代表性序列进行物种注释。采用R中的“vegan”和“ggplot2”软件包进行主坐标分析(PCoA)并作图，采用Gephi^〔14〕软件对OTU和ARGs的相关性数据进行可视化分析，采用R中的“pheatmap”和“ggplot2”软件包进行热图的绘制。采用Trimmomatic^〔15〕软件去除宏基因组测序数据中的低质量序列，并利用Deeparg^〔16〕软件对质控后的宏基因组基因序列进行ARGs注释。

分别采用SBR和MBBR反应器处理四环素废水。为了比较两种工艺的污染物去除效果，在反应器运行过程中我们通过排泥来保证所有反应器保持相同的生物量。处理后出水水质数据见图 1。

出水中氨氮和总氮数据如图 1(a)所示，SBR的氨氮去除效果较好并且非常稳定，受四环素浓度影响较小，而MBBR的出水氨氮则受四环素影响较大，在Phase Ⅱ和Phase Ⅲ的开始阶段，出水氨氮都会显著升高，分别达到16 mg/L和28 mg/L左右，后续逐渐降低。四环素浓度对SBR和MBBR两种工艺的氨氮去除的影响存在差异，原因可能是四环素对硝化细菌有抑制作用，而硝化细菌在活性污泥中的相对丰度显著高于其在生物膜中的相对丰度^〔17〕，并且硝化细菌大多分布于生物膜表面，因此，生物膜中硝化细菌更容易受到四环素毒性的影响。SBR和MBBR出水中的总氮也存在显著差异，SBR对总氮的去除效果较差，出水中总氮一直维持在30~40 mg/L，受四环素浓度的影响较小。MBBR的总氮去除效果好于SBR，但是容易受四环素浓度影响，在每个阶段的初期，四环素的浓度升高会导致出水总氮升高，随后会逐渐稳定在20 mg/L左右。SBR和MBBR的总氮去除效果存在差异的原因可能是因为MBBR生物膜由外至内逐渐从好氧环境过渡到厌氧环境，有利于硝化细菌和反硝化细菌的共存和协同代谢^〔18〕。

由图 1(b)可以看出，反应器运行过程中COD去除受四环素浓度的影响较小，原因可能是因为污水中的简单碳源(葡萄糖)容易被微生物利用，而难生物降解的低浓度四环素对COD的贡献不大，所以在反应器不同阶段出水中COD的波动较小。

图 1(c)展示了SBR和MBBR出水中四环素的浓度，在Phase Ⅰ和Phase Ⅱ阶段，两种反应器对四环素的去除效果相差不大，但是在Phase Ⅲ阶段，SBR和MBBR对四环素的去除效果出现明显差异，SBR稳定阶段出水中四环素质量浓度在400 μg/L左右，而MBBR中的四环素则几乎全部去除。这一结果说明，在本研究条件下，当进水中四环素质量浓度较低(< 500 μg/L)时，活性污泥和生物膜工艺对四环素的去除效果差异不大，但是，当进水中四环素质量浓度升至1 000 μg/L时，生物膜工艺对四环素的去除效果明显好于活性污泥工艺。

活性污泥和生物膜工艺对四环素废水中污染物去除具有显著差异，原因可能是因为四环素具有较高的生物毒性，而活性污泥和生物膜中微生物携带的ARGs存在差异，进而影响微生物的生物活性。我们基于ARGs相对丰度对活性污泥和生物膜样品进行聚类分析，如图 2(a)所示，点之间距离反映了不同样品ARGs的差异，加入四环素的SBR污泥样品离空白对照样品的距离较远，而对于MBBR，只有高浓度四环素条件下的生物膜样品离空白对照样品的距离较远，低浓度条件下样品与空白对照样品聚集在一起。因此，低质量浓度(< 500 μg/L)四环素对SBR中ARGs有较大影响，而对于MBBR只有在高质量浓度(1 000 μg/L)四环素条件下才会产生明显影响^〔19〕。图 2(b)比较了SBR和MBBR中总ARGs的相对丰度，结果表明在不同四环素浓度胁迫下，生物膜中总ARGs的相对丰度都高于活性污泥。图 2(c)比较了SBR和MBBR中四环素类ARGs的相对丰度，结果与总ARGs类似，在不同四环素浓度下，生物膜中四环素类ARGs的相对丰度都高于活性污泥。已有研究表明四环素胁迫可以使活性污泥和生物膜中ARGs相对丰度升高^〔3〕，但是并没有在相同条件下对这两种工艺中ARGs进行比较。生物膜中ARGs相对丰度高于活性污泥可能是导致两种工艺对四环素的去除存在差异的原因。生物膜工艺对四环素的去除效果明显好于活性污泥工艺，但是两种工艺脱氮效果差异与ARGs的关系不大，因为目前尚无证据表明硝化细菌携带与四环素相关的ARGs。图 2(d)展示了SBR和MBBR中四环素类ARGs的具体分布，当四环素质量浓度为50 μg/L时，生物膜中tetX和tetPB的丰度明显高于活性污泥。当四环素质量浓度为500 μg/L时，生物膜中tet36的相对丰度明显高于活性污泥。当四环素质量浓度升高为1 000 μg/L时，生物膜中tetG、tetC、tetB(46)和tetA(48)的相对丰度明显高于活性污泥。这些都是污水处理生物反应器中常见的四环素类抗性基因^〔3〕。

活性污泥和生物膜中微生物群落结构组成可能是导致ARGs存在明显差异的原因，这需要通过研究微生物和ARGs之间的关系来证明。图 3(a)为基于OTU相对丰度的活性污泥和生物膜样品的聚类分析。由图可知，加入四环素之后，活性污泥和生物膜样品之间的距离较大，说明活性污泥和生物膜的微生物群落结构组成存在着明显差异，四环素浓度对活性污泥和生物膜的微生物群落结构组成都有着较大影响^〔3〕。由图 3(b)可知，随着四环素浓度升高，活性污泥中微生物多样性变化不大，生物膜中微生物多样性则变化明显，shannon指数由9.95逐渐降低到3.88。这一结果表明，随着四环素浓度升高，生物膜的微生物多样性降低，某些微生物得到了富集，这些富集的微生物可能是导致生物膜ARGs升高的原因。

主要微生物变化规律如图 3(c)所示，当进水中四环素质量浓度为50 μg/L时，活性污泥中Comamo- nadaceae、Dechloromonas、Flavobacterium、PB19、Bde- llovibrionaceae、Xanthomonadaceae、Saprospiraceae和Rhodocyclaceae的丰度显著上升，而生物膜中只有Rhodocyclaceae、PB19和Bdellovibrionaceae丰度显著升高。此外，在生物膜中Saprospirales、Carnobacte- riaceae、Rhodocyclaceae、Comamonadaceae和Dok59的丰度小于初始接种污泥，而活性污泥中只有Nitrospira和Hyphomonadaceae(denovo8335)下降明显。当四环素质量浓度升高为500 μg/L时，活性污泥中的Comamonadaceae、Dechloromonas、agg27、PHOS-HE93、PB19、Ellin6075、Pirellulaceae、Hyphomonadaceae(de- novo5381)、OPB56丰度显著升高，生物膜中则是HOC36、Rhodocyclaceae、Flavobacterium、Sphingobac-teriales、BME43、BD7-3、Hyphomonadaceae和Cytoph-agaceae丰度明显升高，活性污泥和生物膜中的微生物种类依然存在很大差异。当四环素质量浓度升高为1 000 μg/L时，活性污泥中Rhodocyclaceae、Cyto-phagaceae和Pirellulaceae的浓度显著升高，生物膜中VC2_1_Bac22、Chitinophagaceae、Rhizobiales、Hyph- omonadaceae和Flavobacterium的丰度显著升高，活性污泥和生物膜中丰度升高的微生物种类差异明显。图 3(b)表明可能是某些微生物丰度升高导致生物膜中ARGs丰度升高，因此，不同阶段生物膜中丰度升高的微生物(Rhodocyclaceae、PB19、Bdellovi- brionaceae、HOC36、Flavobacterium、Sphingobacterial- es、BME43、BD7-3、Hyphomonadaceae、Cytophagaceae、VC2_1_Bac22、Chitinophagaceae、Rhizobiales和Flavo-bacterium)都有可能导致ARGs升高，这些大部分都是生物膜中较为常见的微生物^〔3〕，同时这些微生物也有可能具备较强的污染物去除能力，其中Rho- docyclaceae是常见的聚磷菌^〔20〕，Sphingobacteriales和Hyphomonadaceae是潜在的反硝化细菌^〔3〕，Rho- docyclaceae^〔21〕和Sphingobacteriales^〔22〕对难降解有机物(甲苯、萘等)有着非常好的去除效果。

为了进一步探究微生物群落结构和ARGs之间的关系，我们对微生物OTU和四环素类ARGs进行了相关性分析。图 4(a)表明，tetB、tetM、tetA(60)、tet34、tet36、tetH、tetP(A)和tet31基因与微生物的相关性较高(至少与8个OTU的相关性系数大于0.8)，说明这些基因的相对丰度受微生物群落结构的影响较大。同时图 2(d)已经证明四环素胁迫会导致tet36丰度显著升高，这一结果也说明了tet36丰度升高可能是携带该基因的微生物被富集引起的。对图 4(a)中与ARGs相关性较高的微生物进行统计，发现Proteobacteria和Bacteroidetes的相对丰度最高〔图 4(b)〕，其中Proteobacteria的相对丰度能够达到55%，Bacteroidetes的相对丰度为18%，这说明Pro- teobacteria和Bacteroidetes对ARGs的组成有较大影响。图 4(c)为与微生物相关性高的四环素类ARGs及对应的相关性较高的微生物，该图表明不同四环素类抗性基因与不同的微生物(Family)具有较高的相关性，其中tetM和tetA与Rhodocyclaceae和Comamonadaceae的相关性较高，tet34和tetH与Saprospiraceae的相关性较高，tet36与Chitinophaga- ceae相关性较高，tetP(A)和tet31与Rhodocyclaceae的相关性较高。这些细菌大部分都是生物膜中常见的携带ARGs的细菌，例如Pseudomonas会携带抗性基因tet(A)、tet(M)、tet(O)和tet(W)^〔3〕。

通过比较活性污泥和生物膜工艺对四环素废水的处理过程，发现生物膜工艺对总氮和四环素的去除效果均优于活性污泥工艺。通过对活性污泥和生物膜中ARGs进行比较分析，发现生物膜中ARGs的相对丰度高于活性污泥，因此，ARGs可能是造成两种工艺对四环素废水中污染物去除效果有所差异的原因。通过对活性污泥和生物膜的微生物群落结构进行分析，发现存在与ARGs相关性较高的微生物类群，这些微生物可能对四环素废水中污染物的去除起主要作用。