生产长链二元酸的主要方法有催化油脂法、化学合成法和生物发酵法，其中生物发酵法较另外两种方法在合成难易和经济性方面都有极大的优越性^〔1-2〕。然而利用生物发酵法生产长链二元酸的一大难题就是工艺废水难处理，其硫酸盐质量浓度高达10 000~40 000 mg/L，COD超过6 000 mg/L。

由于该废水中含有大量硫酸根离子，采用传统厌氧生物法，除有机物被分解成甲烷外，硫酸盐还会在硫酸盐还原菌（SRB菌）作用下还原成S^2-离子，对微生物菌群尤其是产甲烷菌具有较大的抑制和毒害作用^〔3〕，且该酸化废水SO₄^2-/COD比及盐度均高于现有文献〔4〕、〔5〕的讨论值，因此单相厌氧不可取。为避免厌氧过程中SRB菌与产甲烷菌的相互竞争，两相厌氧工艺因能兼顾相分离和硫化物脱除而受到重视。例如M. A. M Reis等^〔6-7〕证明了有机物酸化菌和SRB菌可以高效共生，从而实现产酸-硫酸盐还原相和产甲烷相的分离；C. H. Wei等^〔8〕以射流循环厌氧流化床反应器（JLAFB）作为硫酸盐还原相，厌氧流化床反应器作为产甲烷相，可有效避免硫化物和游离H₂S的积累及对微生物的抑制。但两相厌氧工艺对pH、温度、吹脱气、盐度、碳硫比等条件要求较苛刻，其操作难度高、抗冲击能力差。

好氧工艺是最常规的污水处理工艺，具有适用范围广、操作简便、恶臭产生少的特点。近年来越来越多的耐盐菌株被国内外学者发现并利用^〔9-12〕，但针对长链二元酸酸化废水，好氧菌不仅需要非常高的耐盐特性，还需要耐受S^2-毒性的能力，以适应局部厌氧产生的S^2-离子。

本研究从某企业污水处理场生化污泥中筛选并分离出一株耐盐菌GXNYJ-12，探讨了盐浓度、硫化物浓度、pH、温度等对菌种生长和苯酚降解的影响，并在实际二元酸酸化废水中进行检验，为高硫酸盐有机废水的生物强化处理提供参考。

菌源取自某炼化企业污水处理场生物污泥。高硫酸盐有机废水选用长链二元酸中试装置某一批次酸化废水，水质分析结果如表 1所示。

初筛培养基（g/L）：蛋白胨5，牛肉膏2.5，NH₄Cl 1，KH₂PO₄ 0.5，NaCl 3，FeSO₄ 0.02，CaCl₂ 0.03，MgSO₄ 1，Na₂SO₄ 26，以蒸馏水配制，pH 7.0，120 ℃高压蒸汽灭菌20 min，固体培养基中琼脂20 g/L。

复筛培养基（g/L）：蛋白胨5，牛肉膏2.5，NH₄Cl 1，KH₂PO₄ 0.5，NaCl 3，FeSO₄ 0.02，CaCl₂ 0.03，MgSO₄ 1，Na₂SO₄ 46，以蒸馏水配制，pH 7.0，120 ℃高压蒸汽灭菌20 min，使用时加入0.3 g/L Na₂S，固体培养基中琼脂20 g/L。

初筛：将10 mL所取污水处理场泥水混合物加入100 mL初筛液体培养基中，于30 ℃、150 r/min恒温摇床培养，48 h后取1 mL菌液转接至新的初筛液体培养基中再次培养。按上述方法转接3次后，取最终菌液100 μL，用蒸馏水进行梯度稀释后取稀释液涂布于初筛固体培养基上，在35 ℃恒温培养箱中培养48 h，待长出菌落后采用平板划线法分离，3~5次划线分离后，通过肉眼和显微镜观察菌落形态，确定初筛得到的纯化菌株数量。

复筛：取初筛最终菌液1 mL加入100 mL复筛液体培养基（高盐高硫化物）中，按照上述方法培养及转接3次，取转接后菌液100 μL用蒸馏水进行梯度稀释，稀释液涂布于复筛固体培养基上，同样35 ℃恒温培养48 h并采用平板划线法得到纯化的菌株。

16S rDNA序列分析由中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）完成。测序结果与专业数据库（以NCBI数据库为基源）进行序列比对，采用软件MEGA5.0中邻位相接法构建系统发育树，相似度重复计算超过1 000次。

（1）以Na₂SO₄为主体配制不同盐浓度的苯酚废水，补充适量氮源、磷源，调节pH至7，然后将筛选纯化的菌株按照1∶100比例接入模拟废水中，于30 ℃、150 r/min恒温摇床培养96 h，测取各个时间段的生物量及反应前后COD值，以考察菌株耐盐性能。

（2）取按上述方法配制的质量分数为5%的苯酚废水，加入纯化菌株，考察不同初始S^2-浓度、pH、温度对菌株生长及苯酚降解的影响。

（1）将筛选纯化的菌株加入实际长链二元酸酸化废水中，采用摇床试验法，通过调节氮源加入量考察菌株在有机物降解中对氮源的依赖及氮转化途径。

（2）采用自制有机玻璃反应器，内径200 mm，高400 mm，沉底曝气，反应为间歇式，放置在30 ℃恒温水浴槽中，废水装填体积6 L，投加菌液至MLSS为5 g/L，在充分曝气基础上（溶解氧≥2 mg/L）考察菌株降解长链二元酸酸化废水的能力。

样品前处理方法：取适量水样，10 000 r/min下离心5 min，然后在0.45 μm滤纸下真空抽滤，收集滤液；用二氯甲烷在酸性和碱性条件下分别萃取三次，收集有机相并合并，经无水硫酸钠脱水和高纯氮气吹扫浓缩至1 mL后进行GC-MS分析。

GC-MS分析采用赛默飞气相色谱-质谱联用仪。气相色谱条件：TraceGOLD TG-5ms毛细管色谱柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；柱温箱起始温度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min升至270 ℃，保持19 min；离子传输线270 ℃；载气为高纯氦气，恒流1 mL/min；进样量1 μL。质谱条件：电子轰击源（EI），离子源温度280 ℃，全扫描，扫描范围35~400 u。通过目标组分质谱图和保留时间与计算机谱库作对照进行定性分析。

试验仪器：天津欧诺HNY-100D台式恒温摇床，上海光谱754PC型紫外可见分光光度计，日立CR21N高速冷冻离心机，SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵，赛默飞世尔Trace 1310-ISQ7000气相色谱-质谱联用仪。

分析方法：生物量测定采用紫外分光光度法，由菌液在波长600 nm处的吸光度值表示，记做OD₆₀₀值，生物增加量=〔（OD_600反应后－OD_{600反应初始}）/OD_{600反应初始}〕 ×100%。COD由重铬酸盐法测定；总氮采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法；氨氮采用气相分子吸收光谱法；硝酸盐氮采用酚二磺酸分光光度法；亚硝酸盐氮采用分光光度法；硫化物采用碘量法；硫酸盐、含盐量采用重量法。

经过初筛及分离纯化，可获得3株菌株，进一步复筛后仅得到1株耐盐菌，该菌株可在5%盐浓度下稳定存活，并能耐受一定的S^2-毒性，命名为GXNYJ-12。通过CICC鉴定分析（鉴定报告编号为19-368-1424-1636），菌株GXNYJ-12在TSA培养基上的菌落呈浅黄色，圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐，其微观形态观察呈杆状，单个或成对排列，革兰氏阴性。经16S rDNA测序分析和BLAST比对，菌株GXNYJ-12与Halomonas nigrificans相似度达99%以上，该菌株已经被CGMCC保藏，保藏编号为CGMCC No.20350。其系统进化树见图 1。

菌株GXNYJ-12在不同盐度下生长情况如图 2所示，在不同盐浓度下降解苯酚的能力如图 3所示。

由图 2、图 3可知，在1%和5%盐度下，菌株数小时后便进入对数生长期，24 h左右已进入稳定生长期。相对应的是9%和13%盐度下的菌株经历20 h适应期后才进入对数生长期，而适应期的延长并未影响菌株活性，经历96 h生长后，菌株在13%盐度下的生物增加量高达172%，COD去除率高达77.1%，充分说明该菌株具有很高的适应能力和耐盐特性。17%~25%盐度下菌株的适应期相对更长，但生物量仍呈缓慢增长趋势，最终对苯酚仍有50%的去除效果。由图 3还可知菌株降解苯酚效率最高的盐度区间为5%~13%，反映出菌株的嗜盐特性。在1%盐度下，反应中期其生物量最大则可能是该普通盐溶液混入了大气中常规微生物。

Yu Jiang等^〔9〕筛选的嗜盐菌JS4在盐度低于7%时对苯酚都有非常高的降解率，但盐度升至13%时对苯酚几乎无降解，盐度升至17%时菌株无生长。王丽娟等^〔10〕发现芽孢杆菌CCZU-R6在11%盐度下可以有效降解苯酚，当盐度升至14%时苯酚无降解。与现有耐盐菌相比，菌株GXNYJ-12因其盐适应范围广、降解能力强在高盐污水处理中更具优势。

实际硫酸盐废水在处理、转运、储存过程中会因局部厌氧产生S^2-离子，而废水中绝大部分微生物对S^2-耐受能力较差^〔13〕。基于此，配制5%盐度苯酚溶液，加入不同量的硫化钠，静置24 h，然后摇床培养48 h，考察该菌株对S^2-耐受能力，结果如图 4、图 5所示。

24 h静置过程中各反应瓶瓶口的恶臭气味明显。24 h后，随着摇床培养的开始，由图 4可知，菌株都逐步进入生长期，但因为S^2-毒性影响，菌株在无S^2-、少S^2-反应液中生长较快。随着反应进行，S^2-逐步被溶入的空气氧化，高S^2-溶液内的菌株也开始加快生长。48 h摇床试验结束后，各反应液生物增加量均超过150%，苯酚COD去除率均超过45%。因此菌株GXNYJ-12具有较强耐受S^2-毒性的能力，这跟其长期在高硫酸盐环境中生存、驯化有关。

近年来，耐盐菌的研究在考察其耐盐特性的同时也开始关注菌株的功能特性，如王攀等^〔11〕筛选的耐盐菌HY-3在耐盐同时具有合成聚羟基脂肪酸酯（PHA）的能力，杨重等^〔12〕发现的两株耐盐菌具有铬移除特性。上述菌株都是在NaCl盐溶液中筛选出来，而在Na₂SO₄盐溶液中筛选菌株的报道少之又少，因此与现有耐盐菌相比，菌株GXNYJ-12具有优异的耐S^2-毒性的能力，在高硫酸盐污水处理中更具优势。

pH、温度对菌株生长和代谢有着重要作用^〔14〕，其对菌株生长及苯酚降解影响分别如图 6、图 7所示。

从图 6可知，在pH为8时，苯酚溶液COD去除率最高，48 h后其数值可达70.5%，对应的OD₆₀₀也最高；当pH小于7或pH大于9时，苯酚溶液COD去除率和OD₆₀₀值均锐减。从图 7可知，在15~30 ℃时，苯酚溶液COD去除率及菌株生物量随着温度增加而增加；当温度超过35 ℃，COD去除率和生物量明显下降，因此菌株生长最适温度为30 ℃。

为进一步考察菌株GXNYJ-12在实际废水中的处理能力，特选取长链二元酸酸化废水为研究对象，该废水中有机物不仅种类多而且浓度高。由表 1可知，其COD高达8 125 mg/L，硫酸盐高达28 000 mg/L，盐含量经pH调节后盐度接近5%，与之相反的是废水氨氮很低，仅为21.5 mg/L。考虑氮源是菌体细胞物质和含氮代谢物合成必不可少的营养元素，特用氯化铵配制不同浓度梯度的氮源，采用摇床试验法考察菌株处理该废水时对氮源的依赖及氮转化途径，结果如图 8、图 9所示。

从图 8可知，在外加氮源200 mg/L、反应时间28 h条件下，OD₆₀₀达到最大值，超过此氮源投加量，菌株生物量并没有明显提升，但低于此氮源投加量，菌株不仅生物量偏少，而且衰亡期早、衰亡速度快。该废水虽然氨氮含量少，但还有100 mg/L左右的有机氮，在零外加氮源条件下，菌株在初期仍能够正常生长，同样可以满足菌株生长的需要。

由图 9可知，通过对反应后氨氮、硝态氮、亚硝态氮浓度分析可知，反应后氨氮质量浓度最高为37 mg/L，说明氮源都被充分利用，而硝态氮和亚硝态氮质量浓度均在5 mg/L以下，说明未发生硝化反应，推断该菌株无硝化功能，其在好氧条件下对氨氮的转化方式主要为同化作用^〔15〕，同时也有可能伴随少量污泥吸附^〔16〕。考虑到该菌株本身不具有硝化功能，并结合菌株生长趋势和COD去除效果，确定最佳氮源投加质量浓度为200 mg/L。

考虑摇床试验法在处理高浓度废水时会存在溶解氧不足的问题，特自制反应器，利用增氧泵充分曝气，在30 ℃、pH 7、污泥初始质量浓度5 g/L、外加氮源200 mg/L的条件下，采用菌株GXNYJ-12开展二元酸废水深度降解试验，试验结果如图 10所示。

由图 10可知，在接近5%盐度的酸化废水中菌株GXNYJ-12生长迅速，生物量大幅度增加，24 h后进入稳定生长期。伴随着生物量的快速增加，其COD也得到明显去除，48 h后COD已低至776 mg/L；此后有机物相对不足，菌株生物量开始减少，COD去除也逐渐变慢。充分曝气96 h后，溶液COD已低于500 mg/L，满足进入市政或工业园区二级污水处理场的要求。经过144 h的深度处理，COD为455 mg/L，趋于稳定。

对二元酸酸化废水原水及144 h后的好氧生化出水进行GC-MS分析，其二氯甲烷可萃取有机物的色谱分析结果见图 11、图 12。

通过GC-MS联机自动检索功能，对色谱图中的出峰物质进行定性分析，长链二元酸工艺废水共检测到可萃取有机物41种，生化出水共检测到可萃取有机物14种，出水有机物种类大幅度减少。废水中含量较高的有机物如表 2、表 3所示。

从表 2可知，原水中含量较高的有机物主要分为内酯类、呋喃酮类和苯类，分子结构上来看主要为五元环、六元环、苯环等分子结构稳定的化合物，例如含量最高的两种有机物丁内酯和（R）-二氢-5-甲基-2（3H）-呋喃酮均为含氧原子、含酮基的五元杂环，均由羧酸分子中的羟基（—OH）和羧基（—COOH）脱水生成。由表 3可知，含量最多的有机化合物为2-氯环己醇，在结构上属于稳定六元环结构，其在原水中也存在（表 2），剩下的有机物也多为环烯烃、环烷烃、苯类等结构稳定化合物。

结合图 11、图 12、表 2、表 3，综合分析可知长链二元酸工艺废水原水有机组分众多，通过菌株GXNYJ-12可以去除大部分有机物，其中甚至包括内酯类、呋喃酮类等相对稳定的化合物，但对于结构更加复杂的化合物其处理能力有限，这也是好氧生化试验COD最终稳定在450 mg/L的原因，要想实现COD达标排放，还需采取其他方法进一步处理。

（1）从某炼化企业污水处理场生化污泥中筛选并分离出一株高效耐盐菌株GXNYJ-12，经鉴定该菌株为盐单胞菌属（Halomonas sp.）。该菌株可在0~25%盐度下有效降解苯酚，在13% 盐度下，反应96 h，苯酚溶液COD去除率高达77.1%。单因素试验显示其具有较强耐受S^2-毒性的能力，其生长所需最适pH为8，最适温度为30 ℃。

（2）该菌株可有效降解COD 8 132 mg/L、硫酸盐浓度28 000 mg/L、含盐量接近5%的长链二元酸酸化废水，好氧生化反应96 h后COD降至500 mg/L以下，满足进入市政等二级污水处理场要求。反应中需投加氮源，该菌种不具有硝化功能，综合考虑氮源投加质量浓度为200 mg/L。

（3）GC-MS分析可知该菌株降解性能优异，能有效去除长链二元酸酸化废水中绝大部分有机物，为后续废水深度提标或脱盐、零排放打下基础，同时也为其他高硫酸盐有机废水的处理提供参考。