生物膜法是利用黏附在载体表面的微生物，对流经载体界面的污染物进行吸附、降解的过程。与传统活性污泥法相比，生物膜法微生物群落丰富、生物量高，对污染物的去除能力较强，抗冲击负荷能力更好〔4〕。据报道，生物膜法对温度的敏感度低〔5-6〕，在低温污水处理中仍有较好的去除效果和较强的适用性〔7-8〕。Junguo He等〔9〕和G. Mannina等〔10〕提出在活性污泥系统添加悬浮填料能提高微生物对低温的适应能力，保持较高活性，有效提升低温反硝化脱氮能力，并推测其原理为：低温下填料表面形成的生物膜分泌更多EPS，EPS产生的空间力形成细菌嵌入的基质，有利于微生物黏附和生长，保持高比生物活性。马华敏等〔11〕和徐巧等〔12〕在低温条件下用悬浮填料强化活性污泥系统，脱氮效率均明显提高。
笔者建立了上流式固定床生物膜反应器（UFBR），通过逐步降温和提升进水负荷的运行方式，比较低温下其与传统悬浮活性污泥反应器（SASR）的反硝化脱氮效果、反应器内微生物特性及群落结构的差异，以期为解决冬季脱氮效率低的问题提供理论基础与实践经验。
1 实验部分
1.1 实验装置及运行条件
实验设置2组反应器UFBR和SASR。反应器采用有机玻璃制成，由内外两层组成，外层为冷却水循环，直径15 cm，高度34 cm；内层为反应器进水，直径10 cm，高度50 cm，有效体积约3 L。反应器内温度由冷水循环机控制，进水流量由蠕动泵控制。SASR内仅装有悬浮活性污泥；UFBR装有悬浮活性污泥和填料，填料为AnoxKaldnes KMT型高密度聚乙烯（HDPE）K1填料，密度0.96 kg/m3，直径为10 mm，填充率约50%。实验装置如图 1所示。
图1
图1
实验装置
1—进水桶；2—蠕动泵；3—玻璃板；4—多孔玻璃挡板；5—冷却水层；6—反应区；7—填料；8—中间水箱；9—冷水循环机
Fig.1
Experimental device
2组反应器接种污泥均来自郑州市五龙口污水处理厂二沉池污泥，污泥质量浓度2 800 mg/L。反应器为连续进水，进水采用人工配水，由混合碳源（主要为乙酸钠和甲醇）、硝酸钠、磷酸二氢钾组成，COD为（90±15）mg/L，硝态氮NO3--N为（20.0±1.5）mg/L，亚硝态氮NO2--N为（0.20±0.07）mg/L，碳氮比为3∶1~5∶1，用稀盐酸控制进水pH为6.8~7.2。
反应器运行分为逐步降温（阶段Ⅰ）和提升硝态氮进水负荷（NLR）（阶段Ⅱ）2个阶段，具体运行条件如表 1所示。
表1 反应器运行条件
Table 1
| 运行阶段 | 运行天数/d | 温度/℃ | NLR/（kg·m-3·d-1） | HRT/h | |
| 逐步降低温度 | 阶段Ⅰ | 0~10 | 16 | 0.08 | 6.0 |
| 阶段Ⅰ | 11~26 | 12 | 0.08 | 6.0 | |
| 阶段Ⅰ | 27~42 | 8 | 0.08 | 6.0 | |
| 提升硝态氮进水负荷 | 阶段Ⅱ | 43~60 | 8 | 0.12 | 4.2 |
| 阶段Ⅱ | 61~90 | 8 | 0.16 | 3.0 | |
| 阶段Ⅱ | 91~113 | 8 | 0.24 | 2.0 | |
| 阶段Ⅱ | 114~131 | 8 | 0.37 | 1.5 | |
| 阶段Ⅱ | 132~160 | 8 | 0.48 | 1.0 | |
1.2 分析方法
（1）常规指标测定。水样在7 000 r/min下离心5 min，之后经0.45 μm滤膜过滤后进行水质分析。用紫外分光光度法和N-（1-萘基）-乙二胺光度法分别测定NO3--N、NO2--N；用重铬酸钾法测定COD〔13〕；pH采用pHB-4型便携式pH计测定。
（2）生物膜扫描电镜。从UFBR取出若干填料，刮取生物膜清洗，经固定、脱水、干燥、喷金处理后进行扫描电镜观察〔14〕。
（4）微生物群落分析。分别在第26、42、90、160天收集SASR的悬浮污泥和UFBR的生物膜，命名为A_26、A_42、A_90、A_160、B_26、B_42、B_90、B_160，并与接种污泥（S_0）在-20 ℃下保存，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行16S rDNA高通量测序分析。
2 结果与讨论
2.1 反应器的启动及运行
微生物对温度变化很敏感，水温低于15 ℃时反硝化速率明显降低。在16 ℃下启动反应器，共运行160 d，出水COD、NO3--N、NO2--N和NO3--N进水负荷（NLR）及NO3--N去除负荷（NRR）随运行条件的变化情况如图 2所示。
图2
图2
UFBR和SASR的进出水指标变化
a— COD；b—NO3--N；c— NO2--N；d— NLR及NRR
Fig.2
Changes of influent and effluent indexes in UFBR and SASR
如图 2（a）所示，阶段Ⅰ（0~42 d）温度从16 ℃降至8 ℃过程中，UFBR出水COD均在18 mg/L左右，降温对COD去除率（均在90%以上）无影响，而SASR出水COD（20~51 mg/L）浮动较大。图 2（b）中，SASR中出水NO3--N也不稳定，浮动范围为1.8~9.9 mg/L，明显高于UFBR（0.3 mg/L左右）。由图 2（c）可见，反应器运行前10天，SASR和UFBR中的NO2--N都略有积累，10 d后UFBR出水NO2--N降至0.2 mg/L左右，而SASR出水在30 d后才降至1.0 mg/L以下。由图 2（d）可见，UFBR的NRR完全接近于NLR〔0.08 kg/（m3·d）〕，而SASR的NRR低于NLR。该阶段结果初步表明UFBR对低温的敏感度低，异养代谢及反硝化脱氮能力高于SASR，可提高微生物低温反硝化脱氮能力。在阶段Ⅱ（43~131 d），UFBR的COD、NO3--N去除率都达到90%以上，NRR接近于NLR，显著高于SASR。第132~160天，随着NLR的提升，HRT为1.0 h时，SASR系统因不能耐受高负荷冲击而崩溃，NRR仅为0.15 kg/（m3·d），出水COD、NO3--N分别达到50、17.0 mg/L左右；UFBR系统可能由于后期形成生物膜太厚而影响了基质传质过程，不能与微生物有效接触，导致出水COD、NO3--N也略微增加，最终NRR稳定在0.32 kg/（m3·d）。另测得K1填料上附着的生物膜量达84.5 mg/g，比徐巧〔17〕在7 ℃下装填K3填料的生物膜反应器的生物膜附着量高。
2.2 生物膜形成
在UFBR运行初期中，肉眼可观察到填料附着的生物膜逐渐增厚。对第42天挂膜的填料进行光学显微镜和扫描电镜观察，分析生物膜的形成过程，如图 3所示。
图3
图3
第42天UFBR中生物膜的形成情况
a、b—光学显微镜照片（10×40倍）；c、d—扫描电镜照片（c×6 000，d×8 000）
Fig.3
Formation of biofilms in UFBR on day 42
2.3 EPS中PN及PS的变化
分别测定SASR和UFBR内悬浮污泥及生物膜产生EPS的主要成分——PN和PS的含量，结果如图 4所示。
图4
由图 4可见，前42天降温过程中，UFBR中生物膜分泌的PN和PS均呈增加趋势。生物膜的特性与EPS量相关，随着生物膜的成熟EPS含量逐渐增加，PN可保护微生物不受低温影响〔19〕。第90天和160天时UFBR中的PN、PS含量明显降低，原因在于生物膜逐渐脱落，以及随着NLR的提升，处于内源呼吸期的细菌数量减少，发生自溶而释放出的EPS也随之减少。整个运行期间，SASR中活性污泥产生的PN逐渐增加，PS则呈相反趋势，以1 g SS计，EPS最终达105.1 mg/g。有研究提出活性污泥产生过量EPS可造成高黏性污泥（非丝状菌污泥）膨胀〔20〕，进一步推测SASR在低温下发生污泥膨胀，导致其脱氮效率低。
2.4 微生物群落分析
2.4.1 微生物多样性分析
污泥和生物膜样品的测序结果如表 2所示。
表2 测序样品的微生物多样性指数
Table 2
| 样品 | 序列数 | OTUs数量 | ACE指数 | Chao1指数 | Shannon指数 | Simpson指数 | 覆盖度 |
| S_0 | 104 209 | 5 504 | 21 257.01 | 13 418.34 | 6.37 | 4.8×10-3 | 0.97 |
| A_26 | 66 198 | 1 398 | 1 853 | 2 023.07 | 3.69 | 0.10 | 0.99 |
| A_42 | 83 352 | 1 335 | 2 080.31 | 1 864.95 | 2.68 | 0.22 | 0.99 |
| A_90 | 78 593 | 1 365 | 2 117.33 | 1 899.46 | 3.03 | 0.15 | 0.99 |
| A_160 | 125 920 | 2 354 | 3 093.37 | 2 919.51 | 3.92 | 0.07 | 0.99 |
| B_26 | 784 062 | 252 | 2 970.46 | 2 753.17 | 5.22 | 0.02 | 0.99 |
| B_42 | 948 692 | 141 | 2 897.64 | 2 693.52 | 4.42 | 0.04 | 0.99 |
| B_90 | 73 473 | 2 064 | 2 851.87 | 2 720.26 | 4.50 | 0.06 | 0.99 |
| B_160 | 93 646 | 2 042 | 2 728.36 | 2 562.31 | 4.52 | 0.04 | 0.99 |
由表 2可见，所有样品的测序覆盖率达97%~99%，表明测序结果能有效反映样品的菌群结构。由微生物多样性指数可知，接种污泥中大部分微生物在SASR及UFBR低温驯化过程中逐渐被淘汰，微生物丰度及多样性均显著降低。然而在反应器运行前90天，SASR中的ACE指数和Chao1指数均明显小于UFBR，160 d时略大于UFBR，表明SASR中的微生物受低温影响，其丰度较生物膜的低，此后可能发生污泥膨胀，导致丰度增加。SASR的Shannon指数明显小于UFBR的Shannon指数，Simpson指数也明显大于UFBR的Simpson指数，表明UFBR中生物膜的微生物多样性更丰富，而SASR中一些微生物不适应低温环境而被淘汰。
2.4.2 菌群结构分析
在属水平，选取丰度＞1%的菌属做柱状图，研究微生物群落分布情况，如图 5所示。
图5
由图 5可见，接种污泥的优势菌属为Sacchari bacteria_genera_incertae_sedis、Novosphingobium；在SASR和UFBR中低温驯化后，优势菌属转变为Simplicispira、Comamonas，但这2种菌属的变化趋势及丰度存在明显差异。Simplicispira为典型的反硝化功能菌属，SASR中Simplicispira的丰度从第42天的42.71%降为第160天的8.31%，说明其不能耐受低温环境而逐渐被淘汰；UFBR中Simplicispira的丰度变化不大，平均为10.78%，推测其受生物膜保护而免受低温影响。Comamonas为一种耐冷的反硝化菌属，SASR中Comamonas的丰度很高，最高达20.93%。据报道，Comamonas在纯菌和混合菌中都会分泌大量EPS〔21-22〕。结合SASR中的EPS含量、实验中污泥流失现象及未检测到相关丝状菌，判定SASR中发生了高黏性污泥（非丝状菌污泥）膨胀，这与之前柴春省〔20〕提出的低温环境易使活性污泥发生膨胀的研究结果一致。而S. Andersson等〔22〕提出Comamonas产生的EPS对生物膜的形成、稳定性和结构起至关重要的作用。因此，UFBR中较低丰度的Comamonas可能与反应器填料上生物膜的稳定形成有很大相关性。此外，Acinetobacter、Hydrogenophaga、Pseudomonas、Methylophilus、Methyloversatilis等污水中常见反硝化菌属的最适生长温度为28~35 ℃，低温导致其活性降低或消失〔23〕。这些菌属的丰度在SASR中都随温度的降低而降低，如Acinetobacter丰度降低6.32%，以甲基为主要能源、碳源的Methylophilus丰度降低28.28%，而UFBR中这些菌属丰度相对稳定。综上，在低温下生物膜保护微生物免受低温影响，微生物多样性更丰富；活性污泥在低温下易发生高黏性污泥膨胀，且反硝化功能菌属不适应低温环境，丰度显著降低。
3 结论
（1）通过逐步降低温度和提升NLR的运行方式，驯化耐低温高效脱氮生物膜，UFBR在8 ℃下NRR达0.32 kg/（m3·d），比SASR高2倍多。
（2）镜检及扫描电镜表征结果表明，生物膜在低温环境下生长良好，菌种量丰富。
（3）低温下活性污泥产生大量EPS，发生高黏性污泥膨胀，导致脱氮效率严重下降。而生物膜分泌的PN可以保护其微生物免受低温影响，对生物膜的形成和稳定起主要作用。
（4）高通量测序结果证实，低温下活性污泥因高丰度的Comamonas（20.93%）而发生高黏性污泥膨胀，且反硝化功能菌属受低温影响严重，丰度降低；生物膜可保护微生物免受低温影响，反硝化功能菌属（如Simplicispira等）丰度稳定。
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