工业水处理, 2021, 41(10): 67-72 doi: 10.19965/j.cnki.iwt.2021-0081

• 试验研究 •

基于响应曲面漆酶处理杨木碱浸渍废液条件的优化

王旭,1,2, 项钰洲3, 肖生苓1,2, 岳金权,3

1. 东北林业大学工程技术学院, 黑龙江哈尔滨 150040

2. 东北林业大学森林持续经营与环境微生物工程黑龙江重点实验室, 黑龙江哈尔滨 150040

3. 东北林业大学材料科学与工程学院, 黑龙江哈尔滨 150040

Optimization treatment condition of laccase on poplar alkali impregnated waste stream by response surface method

WANG Xu,1,2, XIANG Yuzhou3, XIAO Shengling1,2, YUE Jinquan,3

1. College of Engineering and Technology, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China

2. Heilongjiang Key Laboratory of Forest Sustainable Management and Environmental Microbiology Engineering, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China

3. College of Materials Science and Engineering, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China

通讯作者: 岳金权, 副教授。电话: 13503685136, E-mail: yuejinq@163.com

收稿日期: 2021-07-26  

基金资助: “十三五”国家重点研发计划项目.  2017YFD0601004-2

Received: 2021-07-26  

作者简介 About authors

王旭（1996—），硕士电话：16603695272，E-mail：wangxu961021@163.com , E-mail：wangxu961021@163.com

Abstract

The lignin removal rate and B/C of poplar alkali impregnated waste stream were used as evaluation indexes to investigate the optimal action conditions of laccase and poplar alkali impregnated waste stream under oxygenation conditions by using single-factor experiment and response surface method. The single-factor experiment was conducted to determine the optimal range of factors by setting multiple experimental gradients, and then three levels of each factor in the optimal range were set for response surface analysis to investigate the influence of three factors on the treatment effect including laccase dosage, reaction temperature and reaction time, so as to determine the optimal conditions of action. The experimental results showed that the optimum condition was 157 U/L laccase dosage, 37℃ reaction temperature and 4.56 h reaction time. Under this condition, the predicted lignin removal rate was 42.66% and the B/C was 0.758, the lignin removal rate obtained from the validation experiment was 43% and the B/C was 0.75, which deviated from the predicted value by no more than 1.06% and the optimized result was reliable. The order of the influ-ence of the factors on the lignin removal rate and B/C followed laccase dosage>reaction time>reaction temperature.

Keywords： laccase ; alkali impregnation ; response surface ; lignin removal rate ; B/C

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本文引用格式

王旭, 项钰洲, 肖生苓, 岳金权. 基于响应曲面漆酶处理杨木碱浸渍废液条件的优化. 工业水处理[J], 2021, 41(10): 67-72 doi:10.19965/j.cnki.iwt.2021-0081

WANG Xu. Optimization treatment condition of laccase on poplar alkali impregnated waste stream by response surface method. Industrial Water Treatment[J], 2021, 41(10): 67-72 doi:10.19965/j.cnki.iwt.2021-0081

化学机械浆生产方法多样，基本制浆原理都是通过化学软化和后续机械磨解以使纤维分离。在化学软化过程中多以NaOH为基本浸渍液，浸渍过程中OH-与纤维素、半纤维素等发生化学反应，同时发生脱乙酰基反应，从而使木片软化、润胀，为后续的磨解分离奠定基础〔1〕。碱浸渍过程在使木片软化的同时，还伴随着半纤维素、木质素、树脂酸和糖醛酸等耗碱类物质的溶出〔2〕，其中木质素是碱浸渍废液中的主要污染物成分。木质素由3种苯丙烷单元通过醚键和碳碳键相互连接形成的具有三维网状结构的生物高分子，其中的酚类化合物及其衍生物具有毒性和生物抑制作用，结构复杂，具有高异质性，可导致废液可生化性差，处理难度较大〔3-4〕。碱浸渍废液为高浓度有机废液，此类废液成分复杂，污染程度较高，因此，研究如何对该类废液进行有效处理十分必要〔5-9〕。

漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一种多酚氧化酶，广泛存在于自然界中，其对木质素具有高效的降解能力，可通过氧化降解和聚合反应作用于木质素。漆酶是一种单电子氧化还原酶，可氧化大量芳香胺、酚类、芳香羧酸及其衍生物，其反应速度是木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）的10~100倍；另外，多项研究表明，漆酶可通过与酚类物质的聚合反应实现去毒作用〔10-11〕。与传统的物理化学方法相比，采用漆酶预处理制浆废液，具有效能高、作用条件温和、反应设备简单的优点。漆酶的主要作用对象为木质素，而木质素的去除有利于提高废液的可生化性。在氧分子存在条件下，漆酶能够氧化降解木质素的酚型结构单元〔12〕，而废液的生物降解性能普遍采用B/C（BOD5/COD）表示。因此，木质素去除率和B/C是衡量漆酶对废液预处理效果的重要指标。

前期实验研究表明，由于碱浸渍废液中木质素含量较高，直接采用生化法对其进行处理效果不佳。为降低废液中的木质素含量，本研究采用漆酶对碱浸渍废液进行预处理。由于漆酶的成本较高，为提高漆酶对废液的预处理效率，最大限度降低经济成本，以木质素去除率和B/C为评价指标，通过单因素实验和响应曲面法对其作用条件进行了优化。

1 实验方法

1.1 实验材料及仪器

实验材料：杨木，取自吉林省白河林业局；漆酶（酶活性为120 U/g），上海源叶生物科技有限公司。浓硫酸（H2SO4，纯度98%），天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸亚铁铵〔（NH4）2Fe（SO4）2·H2O〕、邻菲罗啉（C12H8N2·H2O），天津福晨化学试剂有限公司；硫酸汞（HgSO4），姜堰市环球试剂厂；硫酸银（Ag2SO4），天津东聚隆化工技术开发有限公司；3，5-二硝基水杨酸（DNS），上海展云化工有限公司；氢氧化钠（NaOH）、亚硫酸钠（Na2SO3），天津市东丽区天大化学试剂厂；苯酚（C6H5OH），天津市致远化学试剂有限公司；重铬酸钾（K2Cr2O7），天津市光复科技发展有限公司。以上试剂均为分析纯。

仪器：BODTrakTM Ⅱ型BOD测定仪，美国哈希公司；T6新世纪型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；RE-5299型旋转蒸发仪，上海况胜实业有限公司；PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器有限公司；101-3A型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；DZ-1BCⅡ型真空干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 杨木碱浸渍废液的制备

将杨木加工成规格为长20~40 mm、宽3~5 mm的杨木片，采用烘干法测定其含水率以确定绝干质量。化学浸渍条件：NaOH质量分数为6%，杨木和水的固液质量比为1∶4，浸渍温度100 ℃，保温时间1 h。浸渍过程完成后，过滤，制得NaOH浸渍废液。

1.2.2 漆酶氧化杨木碱浸渍废液实验

向过滤后的杨木碱浸渍废液中滴加乙酸-乙酸钠缓冲溶液调节pH至6.0~6.5，然后加入适量漆酶〔13〕，在一定的条件下反应一定时间。取样，测定其中的木质素含量、COD和BOD5。废液中木质素含量采用紫外-可见光谱法测定〔14〕，COD采用快速密闭消解法测定〔15〕，BOD5采用微生物传感器快速测定法测定〔15〕。

1.3 实验设计

1.3.1 单因素实验设计

以漆酶投加量（X1）、反应时间（X2）和反应温度（X3）为影响因素进行单因素实验，每组实验设置3个平行，结果取平均值。

漆酶投加量影响实验：通过查阅资料与前期实验可知〔13, 16〕，漆酶投加量在50 U/g（即1 g木质素中含有50 U漆酶）时，可与木质素发生高效反应。根据前期废液中木质素含量测定结果，选择50~175 U/L作为漆酶投加量实验区间，以25 U/L为增量。

温度影响实验：根据前期实验结果及文献记载〔17-18〕，漆酶的适宜反应温度通常为25~50 ℃。温度过低会抑制漆酶活性，温度过高会严重破坏漆酶活力。因此，选择25~50 ℃为反应温度实验区间，以5 ℃为增量。

反应时间影响实验：为了探究漆酶与木质素反应完全所用时间，提高预处理效率，根据资料研究结果〔13, 19〕，选择1~6 h为反应时间实验区间，增量为1 h。

1.3.2 响应曲面优化实验设计

根据单因素实验结果，通过响应曲面法（Box-Behnken Design，BBD）优化实验，对漆酶作用条件进行进一步优化。因素水平见表 1。

表1   BBD因素水平

Table 1  BBD factor level

编码及水平X1/(U·L-1)X2/℃X3/h
-1125204
0150305
1175406

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2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 漆酶投加量

在反应温度为40 ℃，反应时间为5 h的条件下，探究了漆酶投加量对处理效果的影响。结果表明，当漆酶投加量＜150 U/L时，木质素去除率和B/C随漆酶投加量的增加呈现升高趋势。投入漆酶量过少，酶反应程度过小〔20〕，参与氧化和降解反应的木质素较少；逐步增加漆酶的投加量，酶与木质素的反应程度提高，被氧化降解的酚型木质素增加，使得木质素去除率和B/C不断升高。但当漆酶投加量为150~175 U/L时，木质素去除率与B/C出现了小幅度降低。确定150 U/L为漆酶的最佳投加量。

2.1.2 反应温度

在漆酶投加量为150 U/L，反应时间为5 h的条件下，探究了反应温度对处理效果的影响。结果表明，当温度从20 ℃升到30 ℃时，木质素去除率和B/C均大幅度升高；当温度＞30 ℃时，随着温度的升高，2个指标均呈下降趋势，30 ℃为最佳反应温度。反应温度直接影响漆酶的活性。温度过低，漆酶活性较低，氧化酚型木质素结构单元的程度和效率较低，不利于废液中木质素的去除，从而不利于可生化性的提高；温度过高，酶失活，也不能高效地将木质素结构单元氧化成酚氧自由基进行下一步的非酶催化反应，同样达不到去除木质素、提高废液可生化性的目的。

2.1.3 反应时间

在漆酶投加量为150 U/L，反应温度为40 ℃的条件下，探究了反应时间对处理效果的影响。结果表明，当反应时间在2~5 h时，木质素去除率与B/C随反应时间的增长呈现增长趋势；5 h后，2个指标不再随反应时间的增长而升高，5 h是漆酶预处理杨木碱浸渍废液的最佳反应时间。漆酶与木质素充分反应需要一定的时间，但由于漆酶氧化形成的酚氧自由基同时有聚合和解聚2种倾向，如反应时间过长，酚氧自由基会发生聚合反应，形成更高分子质量的木质素结构。

2.2 响应曲面模型建立和分析

根据单因素实验确定的X1、X2和X3较优取值范围，以木质素去除率和B/C为响应值（Y1，Y2），利用响应曲面法（BBD）设计了3因素3水平的实验，具体实验方案及结果见表 2。

表2   BBD实验方案及结果

Table 2  BBD experimental scheme and results

实验组号自变量实验值
X1/(U·L-1)X2/℃X3/hY1/%Y2
112520523.690.675
212540528.320.709
315020631.550.720
417520533.930.722
515030553.030.784
615030550.500.773
717530645.980.733
812530632.810.716
915040636.090.741
1012530429.470.681
1115040431.780.726
1215020427.910.715
1317530437.320.725
1415030550.840.779
1517540532.540.718
1615030548.560.78
1715030550.470.772

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根据表 2，利用Design Expert 10.0软件建立木质素去除率和B/C与3个因素之间的二次回归方程，见式（1）和式（2）。

(2)

表 3是对木质素去除率回归方程系数显著性检验的结果。

表3   木质素去除率模型回归方程系数显著性检验结果

Table 3  Coefficient significance test results of regression equation of lignin removal rate model

方差来源平方和自由度平均方差F值P值显著性
回归模型1533.519170.3968.74< 0.0001显著
X1166.351166.3567.11< 0.0001
X214.18114.185.720.0481
X349.75149.7520.070.0029
X1X26.3016.302.540.1549
X1X37.0817.082.850.1350
X2X30.1110.110.0450.8376
X12302.331302.33121.96< 0.0001
X22715.551715.55288.66< 0.0001
X32152.151152.1561.380.0001
残差17.3572.48
失拟项10.6733.562.130.2391不显著
纯误差6.6841.67
总和1550.8716R2=0.9888RAdj2=0.9744

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由表 3可知，木质素去除率回归方程对应的模型显著（P < 0.0001）。该二次模型R2值为0.9888，RAdj2值为0.9744，均接近于1，因此认为模型准确〔21-23〕。失拟项是评估方程可靠性的重要数据，此回归方程失拟项不显著，表明回归方程拟合较好。此外，从表 3还可以看出，木质素去除率回归方程一次项X1（P < 0.0001）极显著，X2、X3（P < 0.05）显著；二次项X12、X22（P < 0.0001）极显著，X32（P < 0.05）显著；交互项X1X3、X1X2、X2X3不显著。由F值可知，3个因素对木质素去除率影响大小的顺序为漆酶投加量 > 反应时间 > 反应温度。

表 4是对B/C回归方程系数显著性检验的结果。

表4   B/C模型回归方程系数显著性检验结果

Table 4  Coefficient significance test results of regression equation of B/C model

方差来源平方和自由度平均方差F值P值显著性
回归模型0.01891.980×10-381.08< 0.0001显著
X11.711×10-311.711×10-370.07< 0.0001
X24.805×10-414.805×10-419.680.0030
X34.961×10-414.961×10-420.320.0028
X1X23.610×10-413.610×10-414.780.0063
X1X31.822×10-411.822×10-47.460.0293
X2X32.500×10-512.500×10-51.020.3453
X127.313×10-317.313×10-3299.44< 0.0001
X223.771×10-313.771×10-3154.40< 0.0001
X322.070×10-312.070×10-384.780.0001
残差1.709×10-472.442×10-5
失拟项6.975×10-532.325×10-50.920.5079不显著
纯误差1.012×10-442.530×10-5
总和0.01816R2=0.9905RAdj2=0.9783

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由表 4可知，B/C回归方程对应的模型显著（P < 0.000 1）。该二次模型R2值为0.990 5，RAdj2值为0.978 3，均接近于1，认为模型准确〔23〕。失拟项不显著，表明回归方程拟合较好。此外，从表 4还可以看出，B/C回归方程一次项X1（P < 0.000 1）极显著，X2、X3（P < 0.05）显著；二次项X12、X22和X32（P < 0.000 1）极显著；交互项X1X2、X1X3（P < 0.05）显著，X2X3不显著。由F值可知，3个因素对木质素去除率影响大小的顺序为漆酶投加量 > 反应时间 > 反应温度。

2.3 响应曲面交互性分析

响应曲面交互性分析结果如图 1所示。

图1

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图1   多因素交互对木质素去除率和B/C影响的响应曲面

Fig.1   Response surface of multi-factor interaction on lignin removal rate and B/C


由图 1可知，当反应时间恒定时，木质素去除率随漆酶投加量增加而增长的速度较随反应温度升高而增长的速度快；当反应温度恒定时，木质素去除率随漆酶投加量增加而增长的速度较随反应时间增加而增长的速度快；当漆酶投加量恒定时，木质素去除率随反应时间增加而增长的速度较随反应温度升高而增长的速度快。可见，3个因素对木质素去除率影响大小的顺序为漆酶投加量 > 反应时间 > 反应温度。

当反应时间恒定时，B/C随漆酶投加量增加而增长的速度较随反应温度升高而增长的速度快；当反应温度恒定时，B/C随漆酶投加量增加而增长的速度较随反应时间增加而增长的速度快；当漆酶投加量恒定时，B/C随反应时间增加而增长的速度较随反应温度升高而增长的速度快。可见，3个因素对B/C影响大小的顺序为漆酶投加量 > 反应时间 > 反应温度。

2.4 参数优化及验证

以漆酶投加量、反应温度、反应时间作为影响因素，以杨木碱浸渍废液的木质素去除率与B/C作为优化目标，根据实验所得结果及二次回归模型的数学分析结果，设置不同的权重及重要度，通过Design Expert 10.0软件可以得到漆酶处理杨木碱浸渍废液的最佳作用条件组合：漆酶投加量157 U/L，反应温度37 ℃，反应时间4.56 h，在此条件下，预测的木质素去除率为42.66%，B/C为0.758。在最佳条件下进行验证实验，得到木质素去除率为43%，与预测值偏差为0.8%，B/C为0.75，与预测值偏差为1.06%，与预测值基本一致，偏差较小，因此，可以认为优化结果可信。

3 结论

（1）基于响应曲面法建立了杨木碱浸渍废液木质素去除率和B/C的二阶响应面回归方程模型，其R2和RAdj2均接近于1，说明模型具有良好的准确性；实验值与预测值的偏差不超过1.06%，说明该模型可以用于漆酶处理杨木碱浸渍废液作用条件的优化和预测。

（2）漆酶投加量与反应时间的交互作用对杨木碱浸渍废液的木质素去除率影响最大，漆酶投加量与反应温度的交互作用次之，反应温度与反应时间的交互作用影响最小；漆酶投加量与反应温度的交互作用对杨木碱浸渍废液的B/C影响最大，漆酶投加量与反应时间的交互作用次之，反应温度与反应时间的交互作用影响最小。

（3）漆酶与杨木碱浸渍废液的最佳作用条件组合：漆酶投加量157 U/L，反应温度37 ℃，反应时间4.56 h，在此条件下，预测木质素去除率为42.66%，B/C为0.758。通过验证实验得到的木质素去除率与B/C分别为43%和0.75，与预测值基本吻合。

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