焦化废水是煤高温蒸馏或者焦炉煤气冷却以及焦油加工过程中产生的具有高毒性、难降解性的工业废水〔1-2〕。由于原煤性质、炭化温度、煤炭焦化工艺的不同，产生的焦化废水水质水量波动较大，且水质成分较为复杂〔3-4〕。焦化废水中的有机组分主要包括苯酚、甲酚、二甲酚等酚类化合物〔5〕以及喹啉、吲哚、咔唑等含氮杂环化合物〔6〕。酚类在目前工艺条件下易于处理，有研究表明，质量浓度高达500~1 000mg/L的酚类在10 h内可被完全降解〔5〕，而含氮杂环化合物（Nitrogen heterocyclic organic compounds，NHCs）因其结构复杂，相对难以降解。喹啉与吡啶是2种典型的具有高毒性和低可生物降解性的含氮杂环化合物，通常是导致焦化废水排放不达标的原因之一〔7〕。因此，强化喹啉、吡啶等含氮杂环化合物的高效去除是提高焦化废水处理效果的关键所在。
近年来，在研究利用生物强化法处理焦化废水的过程中，已分离得到多种降解喹啉、吡啶的菌株，如苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）〔13〕、丛毛单胞菌（Comamonas sp.）〔14〕、假单胞菌（Pseudomonas sp.）〔15〕、芽孢杆菌（Bacillus sp.）〔16〕等，这些菌株能够将100~1 800 mg/L的目标污染物降解，降解率达到了97%~100%。Xiaodong LIU等〔17〕将吡啶降解菌Rhizobium sp.NJUST18投加到处理焦化废水的序批式间歇反应器（SBR）中，其结果使初始质量浓度为4 000 mg/L的吡啶在7.2 h内得到完全降解，并促进了反应器启动过程。彭湃等〔18〕将自行筛选出的环保菌剂加入到焦化废水处理工艺的厌氧池中，使系统COD平均去除率提高18%，且生化系统中污泥微生物的种类更加丰富。Peng XU等〔19〕将Streptomyces菌投加到处理煤气化废水的MBR反应器中，促进了废水中COD、萘等的去除。这些研究验证了高效降解菌株强化难降解工业废水生物处理的可行性。
本实验室前期分离得到一株红球菌（Rhodococcus sp.）KDPy1〔20〕，该菌能在好氧条件下以喹啉与吡啶为碳源生长，具有生物修复喹啉、吡啶污染的潜力。基于此，本研究将红球菌株KDPy1按照菌液与池容体积比为1∶5添加到以A/O2工艺处理焦化废水的反应器的好氧池中进行生物强化，并对反应器运行期间水质、含氮杂环化合物浓度以及微生物群落的变化进行检测，验证该菌株作为生物强化菌种用于焦化废水中含氮杂环化合物降解的可行性。
1 材料与方法
1.1 菌株特性
实验用高效降解菌是从河北某焦化厂好氧池内分离得到〔20〕，命名为KDPy1，属于好氧革兰氏阳性细菌，菌落形状为球形，不透明，光滑，呈白色，边缘整齐。该菌株被鉴定为红球菌（Rhodococcus sp.）（基因库：KY458569），通过在线BLAST搜索比对发现，该菌与Rhodococcus pyridinivorans（NR025033.1）序列同源性最高，达到100%。其降解喹啉的最大质量浓度为633 mg/L，32 h内降解率达到92.5%；降解吡啶的最高质量浓度为1 442 mg/L，48 h内降解率达到99.6%。其对喹啉、吡啶降解的最佳环境条件：温度为37 ℃、pH为7~8。
1.2 焦化废水特性
原焦化废水和污泥均取自河北省某焦化废水处理厂，其废水处理工艺流程如图 1所示。
图1
前期取焦化废水处理系统调节池中水样检测该厂进水中各污染物浓度，结果显示，废水中的COD、氨氮、硝态氮、硫氰化物、挥发酚、吡啶、喹啉质量浓度分别为2 500、65、8、650、200、250、110 mg/L。在进入生物处理系统反应器之前，需将预处理的废水用自来水稀释，从而减少对微生物的冲击以及毒害作用。由于焦化废水中磷酸盐的含量较低，因此按照m（C）∶m（P）为200∶1向其中添加KH2PO4作为微生物生长所需的磷。
1.3 A/O2系统的搭建与接种
本实验设置2组反应器，一组为对照组，另一组为实验组，对照组不添加强化菌，其余与实验组相同。将对照组标为组1，实验组标为组2。
2组A/O2反应器参考河北某焦化废水处理厂的设计，等比例缩小后由丙烯酸塑料（PMMA）材质制成（见图 2），反应器设计为溢流出水。反应器由缺氧池A（工作容积1.27 L）和好氧池O1（工作容积0.7 L）、O2（工作容积1.59 L）组成。为了减少各工段污泥流失，保持反应器污泥浓度，同时减少出水中悬浮物浓度，每个反应器后接一沉淀池进行泥水分离。反应池上端进水，沉淀池溢流出水，出水进入下一个反应池，沉淀池下端开口将沉淀的污泥回流到前一个反应池，硝化液从最终出水回流到A池。A池上置搅拌器，转速为40 r/min，O1、O2池底部置曝气盘，曝气量（空气）分别为1.2、1.6 mL/min。3个沉淀池的污泥回流比为3∶5∶5，硝化液回流比为1∶2。反应池在室温下运行，保持反应池内污泥浓度及活性稳定，并定期排泥。A池DO保持在0.3~0.5 mg/L，O池DO维持在3~5 mg/L，通过改变添加Na2CO3的量，将pH控制在7~7.5。
图2
图2
A/O2反应器工艺流程
1—调节池；2—进水蠕动泵；3—缺氧池；4—搅拌器；5—沉淀池；6—污泥回流蠕动泵；7—好氧池1；8—曝气泵；9—曝气盘；10—好氧池2；11—硝化液回流蠕动泵。
Fig.2
A/O2 reactor process diagram
2组反应器均接种从河北某焦化厂取来的污泥，A、O1、O2的MLSS分别为4、5、4 g/L。反应器稳定运行100 d后，向实验组好氧池O1中加入菌株KDPy1进行生物强化，另一平行系统不添加强化菌，作为对照组运行。
1.4 细菌的DNA提取与PCR扩增
分别收集生物强化前后各反应池的污泥，进行微生物多样性测序。污泥样本的基因组DNA采用E. Z. N. ATM Mag-Bind Soil DNA试剂盒（Omega，USA）提取，并利用琼脂糖凝胶检测提取出来的DNA完整性以及浓度，接着利用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒（Life，USA）对基因组DNA进行定量，以确定PCR反应中应加入的DNA量。PCR扩增所用的引物已经融合了Miseq测序平台的V3-V4通用引物，引物序列分别为341（CCTACGGGNGGCWGCA）和805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）。经过纯化以及定量后，调整PCR扩增产物的DNA浓度，送由上海生工生物科技有限公司进行测序及有效性处理，所用测序平台为Miseq二代测序仪（Illumina，USA）。
1.5 分析方法
定期（每隔7d）监测分析运行过程中各处理单元水质指标的变化情况，水样主要的分析指标有：喹啉、吡啶、COD、氨氮、硝态氮、硫氰化物的浓度以及pH和DO。喹啉、吡啶浓度采用紫外分光光度法分别在313、256 nm波长下测定〔21〕，COD和氨氮浓度分别采用快速消解分光光度法和纳氏试剂法测定，硝态氮和硫氰化物浓度分别采用双波长比色法和硫氰酸铁分光光度法〔22〕测定，pH和DO分别用pH仪（雷磁PHS-3C型，上海）和DO仪（雷磁JPB-607A型，上海）测定，水质GC-MS分析依据参考文献〔23〕提供的方法进行操作。所有实验数据采用Origin 9.0（Origin Lab Corporation，USA）作图。所有水质测定均重复3次，取平均值用SPSS 20.0（IBM SPSS statis-tics，USA）进行方差分析，采用多因素方差分析模型，并定义p < 0.05为显著，p < 0.01为极显著。
2 结果与讨论
2.1 反应器的运行效果
2.1.1 COD的去除性能
实验室规模的2组A/O2反应器运行了130 d，期间对各池出水中COD浓度进行了检测，结果如图 3所示。
图3
图3
对照组（a）、实验组（b）以及好氧池O1（c）中COD的变化比较
Fig.3
Comparison of COD changes in control group(a), experimental group(b)and primary aerobic pool O1(c)
启动阶段（0~100 d），对污泥进行驯化，使其适应新环境并优化整体反应系统。反应初始的0~60 d，进水COD被控制在1 800~2 100 mg/L，运行一段时间后发现，反应器出水水质波动较大，且COD去除率逐渐降低，主要是由于厂区原水水质发生变化，成分复杂，毒性大，对反应器中污泥冲击较强，故处理效果不佳。因此，在第60~100天，重新调整了进水中原始焦化废水与自来水的比例，将进水COD控制在1 200~1 500 mg/L，使得系统出水中的污染物浓度相对稳定。从图 3（a）和（b）可知，对照组和实验组反应器系统的缺氧池（1-A和2-A）以及一级好氧池（1-O1和2-O1）对污染物有显著的去除效果，对照组和实验组缺氧池COD平均去除率分别达到65.5%和66.3%，好氧池O1对COD的去除率分别为29.6%和31.0%。表明经过长时间驯化，系统内污泥已经基本适应了环境，对废水中的毒性成分产生了耐受性，对污染物表现出明显的降解效果。
在第101天向实验组2-O1池内添加筛选出来的高效降解菌红球菌KDPy1，并在接下来的30 d内，保持运行条件与进水COD范围不变。在这一阶段，对照组和实验组缺氧池（1-A和2-A）的COD去除率相对稳定，分别为68.9%和69.8%，可能是运行期间硝化液回流稀释了缺氧池进水造成的。从图 3（c）可以看出，在第101~130天内，对照组和实验组的O1池出水COD平均分别为321.7、261.5 mg/L，平均COD去除率分别为27.5%和38.9%，表明实验组O1池对COD的去除效果优于对照组，且其COD去除率随着反应的进行慢慢降低。这可能是因为接种的菌株与好氧池O1污泥中的原生微生物发生相互作用实现了生物强化，提高了COD降解率，但其作用效果随着反应器的运行逐渐降低。
2.1.2 氮的去除性能
在第117天分别对实验组和对照组A、O1、O2池出水中的NH4+-N、NO3--N和TN进行了检测，结果如图 4所示。
图4
图4
A/O2系统各处理单元对氮的去除性能
Fig.4
Nitrogen removal performance of each treatment unit in A/O2 system
由图 4可知，对照组和实验组进水NH4+-N、NO3--N和TN分别为96.7、7.8、341.5 mg/L，随着反应器的运行，NH4+-N、TN浓度逐渐降低，NO3--N浓度逐渐升高。在好氧池O1中，可能存在部分硝化细菌，因此NH4+-N出现下降，NO3--N上升。而在好氧池O2中，大量的硝化细菌将NH4+-N转化成NO3--N，NH4+-N迅速降低，NO3--N迅速升高，TN也明显降低。2组系统数据没有显著性差异（p > 0.05），表明添加高效降解菌对系统的脱氮功能没有产生很大的影响。
2.1.3 喹啉、吡啶的去除性能
在第117天分别对实验组和对照组A、O1、O2池出水中的喹啉和吡啶进行了检测，结果见图 5。
图5
图5
A/O2系统各处理单元对吡啶（a）和喹啉（b）的去除性能
Fig.5
pyridine(a)and quinolone(b) removal performance of each treatment unit in A/O2 system
由图 5可以看出，随着反应器的运行，对照组和实验组的喹啉与吡啶浓度都在逐渐降低，其中对照组与实验组O1池的出水吡啶质量浓度分别为60.6、45.2 mg/L，实验组的吡啶去除率比对照组高14.0%；出水喹啉质量浓度分别为58.1、40.4 mg/L，实验组的喹啉去除率比对照组高17.3%。实验组和对照组O1池出水喹啉与吡啶浓度及其去除率均具有统计学差异（p＜0.05，用*表示），表明添加高效降解菌株有利于提高含氮杂环化合物的降解效果。
2.2 废水的有机组成
为了更深入地了解添加高效降解菌对有机污染物去除的影响，利用GC-MS分析了第117天进水、对照组以及实验组出水中有机物的组成。根据相对峰面积计算出废水中有机污染物的相对含量，并作归一分析，结果见表 1。
表1 进出水中有机物的归一化分析
Table 1
| 有机物种类 | 峰面积/% | ||
| 进水 | 对照组出水（1-O2） | 实验组出水（2-O2） | |
| 酚类 | 15.57 | ND | ND |
| 苯 | 0.21 | 3.25 | 1.75 |
| 烷烃 | 26.32 | 55.21 | 59.34 |
| 杂环 | 25.35 | 16.75 | 8.76 |
| 多环 | 0.72 | ND | ND |
| 羧酸 | 0.90 | 12.23 | 13.22 |
| 酮 | 0.17 | ND | ND |
| 醇类 | 29.47 | 0.88 | 1.91 |
| 腈类 | 0.06 | ND | ND |
注：ND表示未检出。
进水水样中共检测出95种有机物，有机物峰相对分散均匀；对照组O2池出水中检测出36种有机物，实验组O2池出水中检测出20种有机物，出水中有机物峰更集中。出水中未降解的杂环化合物为含氧杂环环戊硅氧烷（Cyclopentasiloxane），它作为一种变构抑制剂，会引起蛋白质结构的构象变化，属于抗菌化合物〔24〕。进水中多环化合物、酮类、酚类、苯类和腈类相对质量分数分别为0.72%、0.17%、15.57%、0.21%和0.06%，但对照组和实验组出水中除苯类外其他污染物均未检出，说明该类物质即使具有高毒性和抑制性，仍可通过A/O2处理工艺进行生物降解。苯类的相对质量分数增加是因为在生物降解过程中产生了新的降解中间产物1，3-二叔丁基苯〔Benzene，1，3-bis（1，1-dimethylethyl）〕〔25〕。羧酸类和烷烃类化合物是由大部分污染物转化而来的，因此在2组系统出水中的含量都出现升高。杂环化合物在进水、对照组和实验组出水中的相对质量分数分别是25.35%、16.75%和8.76%，通过添加高效降解菌后出水中杂环化合物的含量明显降低，且出水中喹啉、吡啶的含量降低，吲哚类化合物未检出，说明添加的高效降解菌能够有效降解喹啉、吡啶等含氮杂环化合物。
2.3 微生物群落分析
2.3.1 微生物群落的多样性与丰富度
收集2组系统生物强化后第117天的污泥，利用16SrDNA技术对基因的V3-V4区进行高通量测序。序列数、OTUs和样本的α多样性见表 2。
表2 微生物群落OTUs和多样性参数
Table 2
| 样本 | 反应池 | OTUs | Shannon | ACE | Chao1 | Coverage |
| 对照组 | A | 1762 | 3.85 | 3875.33 | 2898.54 | 0.9896 |
| O1 | 1538 | 4.73 | 3324.85 | 2572.71 | 0.9904 | |
| O2 | 1644 | 4.74 | 2870.43 | 2346.54 | 0.9926 | |
| 实验组 | A | 1783 | 4.17 | 4095.89 | 2853.74 | 0.9897 |
| O1 | 1697 | 4.83 | 3592.44 | 2665.63 | 0.9914 | |
| O2 | 1704 | 4.74 | 2630.35 | 2613.10 | 0.9920 |
Coverage数值越高，表明样本中序列没有被检测出来的概率越低。2组系统的Coverage值均在98.96%~99.26%之间，表明实验结果可以很好地覆盖焦化废水处理过程中的微生物群落信息。Chao1和ACE指数用来估计群落的OTUs数目，代表物种的丰富度，其值越高说明微生物群落的丰富度越高。实验组O1池Chao1和ACE指数分别为2 665.63和3 592.44，均大于对照组的2 572.71和3 324.85，表明添加高效降解菌提高了微生物群落的丰富度。实验组O1池OTUs数目为1 697，也高于对照组O1池的1 538，接种菌株只包含1株，并没有在菌群中占据很高的丰度，但其OTUs却有较大差距，原因是添加的KDPy1菌引起了菌群的演替，使其他降解菌增加。故反应器内菌群的变化不仅仅是由接种菌引起的，还可能是由反应器内活性污泥菌群的变化引起的。Shannon指数用来评价群落的多样性，其数值越大表明微生物群落的多样性越高。实验组O1池的Shannon指数为4.83，大于对照组O1池的4.73，代表添加高效降解菌增加了微生物群落多样性。因此，添加高效降解菌KDPy1有利于微生物群落的演替，进而导致进行生物强化的反应器O1池活性污泥中微生物数量或种类与对照组相比有显著差异。
2.3.2 微生物群落的分类组成
污泥生物降解效率的高低与污泥中微生物群落的组成及其活性息息相关。生物强化第117天2组反应器中活性污泥在门和属水平上的微生物群落分布如图 6所示。
图6
图6
两系统内各单元在门水平（a）和属水平（b）上的菌群分布
Fig.6
Flora distribution of each unit in the two systems at phylum level(a)and genus level(b)
由图 6（a）可知，变形菌（Proteobacteria）和拟杆菌（Bacteroidetes）是2组系统中所有处理池中最优势的2个菌门，占总序列的10.6%~24.1%。除这2个菌门外，缺氧池中的优势菌门还包括Ignavibacteriae（6.1%~6.4%）和酸杆菌（Acidobacteria，2.8%~3.0%），而在好氧池内则以Acidobacteria（4.8%~6.3%）、Ignavibacteriae（3.2~3.9%）、浮霉菌（Planctomycetes，4.3%~6.6%）和硝化螺旋菌（Nitrospirae，3.3%~3.6%）为主。此外，O1池中的生物强化引起了菌群结构的明显改变，相比于对照组O1池，实验组O1池中高效降解菌的加入使得Ignavibacteriae、Acidoba-cteria和Planctomycetes的比例明显减少，Bacteroi-detes比例显著增加。
在属的水平上，2组系统中共检测出638种属。图 6（b）用热图展示了最丰富的32个菌属（至少在一个样本中占1.0%）的相对丰度。结果表明，系统缺氧池A池的优势菌群分别是硫杆菌（Thiobacillus）、Ignavibacterium、丛毛单胞菌属（Comamonas）和Ari-dibacter，分别占26.95%~29.67%、6.06%~6.36%、2.26%~2.30%和1.88%~2.03%。Thiobacillus和Co-mamonas对硫氰酸盐和酚类的降解起着重要作用且具有反硝化能力〔26〕，Ignavibacterium能够有效降解多环芳烃〔27〕，而Aridibacter能将有机酸和各种复杂蛋白质底物分解为小分子物质并参与氮的去除〔28〕，这些菌群的存在保证了缺氧池中有机污染物与硝氮的去除。系统好氧池O1优势菌群分别为Thiobaci-llus、硝化螺菌（Nitrospira）、Ignavibacterium、Aridiba-cter和Ohtaekwangia，分别占9.23%~16.57%、4.85%~5.31%、3.92%~4.17%、4.77%~5.28%和2.99%~3.26%。Ohtaekwangia对芳香烃有机污染物的降解具有重大的帮助〔29〕，Nitrospira的主要作用是将氨转化成亚硝酸盐，再进一步转化成硝酸盐，达到脱氮的目的〔30〕，这些菌群的存在确保了好氧池O1中有机物与氨氮的去除。2组系统O2池中优势菌群主要为Thiobaci-llus、Ohtaekwangia、Nitrospira、Aridibacter和Povaiba-cter，分别占15.10%~17.19%、4.93%~7.09%、4.54%~6.52%、6.09%~6.20%和2.74%~2.80%。Povalibacter具有代谢蒽和苯丙氨酸等多环芳烃的能力〔31〕。同时该池中存在大量的Nitrospira以及Aridibacter，确保了好氧池O2能够发挥稳定的硝化功能。
对2组系统进行比较，可以发现红球菌（Rhodo-coccussp.）KDPy1的添加导致了好氧池O1中菌群的演替，然而该菌在实验组好氧池中并没有占据很高的相对丰度（占比小于1.0%），该现象与Xiaobiao Zhu等〔32〕的报道是一致的，其研究中将Pseudomonas sp.（CGMCC3008）加入到处理焦化废水的MBR反应器中，导致反应器内菌群的剧烈演替，反应器降解酚类、吡啶类、喹啉类等有机物功能大幅加强，但演替后Pseudomonas sp.（CGMCC3008）菌群的相对丰度却很低。而在本研究中随红球菌（Rhodococcus sp.）KDPy1的加入，实验组好氧池O1中降解菌Steno-trophomonas（4.28%）和苍白杆菌（Ochrobactrum）（3.85%）的丰度明显提高，成为优势菌株。现有研究表明，Stenotrophomonas多存在于废水以及土壤中，它能够在一定程度上转化脂肪族和芳香族化合物，降解多环芳烃（PAHs）〔33〕，并且还可用于生物修复，去除重金属铬〔34〕以及铜〔35〕等污染物；Ochrobactrum能够有效降解喹啉〔8〕、苯酚〔36〕以及菲、芘、蒽等多环芳烃〔37〕，还能将重金属Cr（Ⅵ）还原为Cr（Ⅲ），减少铬的毒性〔38〕。综上所述，红球菌（Rhodococcus sp.）KDPy1的添加增强了好氧池O1对多环芳烃和含氮杂环化合物的降解性能，因此实验组系统表现出对多环芳烃、喹啉、吡啶等污染物的更好的去除效果。
3 结论
本研究针对焦化废水中含氮杂环化合物难降解的特点，采用生物强化技术，在A/O2工艺的好氧池O1中添加降解喹啉、吡啶的高效降解菌红球菌（Rhodococcus sp.）KDPy1，以提高焦化废水生物处理的效果。实验结果验证了红球菌KDPy1作为生物强化菌种在焦化废水处理中强化降解含氮杂环化合物的可行性，并得到以下主要研究结论：
（1）与对照组相比，添加了高效降解菌红球菌（Rhodococcus sp.）KDPy1的好氧池O1在第17天后对水中COD、喹啉、吡啶的去除率分别增加了11.4%、17.3%、14.0%。
（2）实验组好氧池O1的微生物群落丰富度指数OTUs、Chao1和ACE均大于对照组，并且多样性指数Shannon也大于对照组，表明由于高效降解菌的添加，反应器好氧池O1的微生物多样性以及丰富度都相应地得到提高。
（3）经生物强化后，微生物群落发生明显的演替，实验组好氧池O1中有机污染物降解菌Stenotro- phomonas、Ochrobactrum更具优势。
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[J].DOI:10.1007/s12182-014-0359-9 [本文引用: 1]
津公网安备 12010602120337号
