白酒行业生产过程中排放的酿造废水是典型的高浓度、重污染工业废水，具有高COD，高悬浮物浓度和高氮、磷浓度等特点。若直接排入水体将引起水体的严重富营养化，严重危害环境^〔1〕。目前，此类废水常采用IC厌氧反应器工艺^〔2〕、UASB反应器工艺、AAO等工艺进行处理，但上述工艺存在着有臭味，出水不达标，运行控制要求高等缺点。而分段进水多级AO工艺作为一种强化脱氮的生物处理工艺，具有脱氮除磷和碳源利用效率高、运行成本低、基建面积小等优点^〔3〕，故本研究采用其作为提标改造工艺，实验依托于四川某浓香型白酒废水处理厂提标改造项目，搭建多级AO小试实验装置，探究其对酿造废水的处理效果，以期为同类别污水厂提标改造提供技术支撑。

活性污泥中的微生物对污染物的去除起重要作用。目前传统的生化处理工艺关注点由多种工艺耦合设计及工艺参数控制等逐渐转向了功能菌群多样性研究^〔4〕。从微生物层面解读多级AO工艺处理酿造废水的过程机理，研究酿造废水的微生物群落特征、揭示污染物去除的相关功能菌群，对调控和优化污水处理系统、有针对性地开展生物法污水处理具有重要意义，也可为同类工艺优势菌种的培养和富集提供经验指导。

实验装置如图 1所示。

多级AO池主体采用有机玻璃制作而成，池体尺寸1 250 mm×200 mm×470 mm，总容积约为75.56 L，所用一体化装置由三座相连的AO池组成，各池废水通过溢流进入下一处理池。三个缺氧池（A1、A2、A3）的容积分别为8、9.62、12.24 L；三个好氧池（O1、O2、O3）的容积分别为10、15.84、19.72 L，好氧池O3内的废水通过溢流至二沉池。3座缺氧池（A1、A2、A3）均内置一直流恒速电动搅拌器，缺氧池底部高60 mm处通过橡胶软管连接进水蠕动泵，采用分段进水的方式进水。

接种污泥取自四川某白酒废水处理中心的二级沉淀池回流污泥，接种污泥质量浓度约为3 500 mg/L。污泥取回后，加入按照COD、NH₄⁺-N、TP配比为100∶5∶1配制的启动用水，开启风机进行闷曝处理，在去除原有污水中的有机成分后排出上清液，开启蠕动泵连续向反应器内通入人工配水驯化污泥。本实验用水中，原水为白酒废水处理厂二级处理池即多级AO反应池进水，配水是由实验室配制的模拟酿造废水，按多级AO工艺进水浓度模拟，其COD 635 mg/L、TP 33.22 mg/L、NH₄⁺-N 63.75 mg/L、pH 6.9~7.3、水温24.5 ℃。人工配水采用乙酸钠、麦可碳、氯化铵、磷酸二氢钾，由于混合型碳源麦可碳里已包含保证微生物生长所必需的各种微量元素，因此无需额外添加。

采用蠕动泵控制多级AO工艺进水量及污泥回流流量，启动初期流量控制为18.5 L/h，实验采用三点进水，总水力停留时间为11 h，进水量分配比例为55∶35∶10。蠕动泵污泥回流比为100%，各级反应池缺氧段溶解氧质量浓度为0.2~0.4 mg/L、好氧段溶解氧质量浓度为5.0~6.5 mg/L。分别采用原水占比0、30%、70%、100%的废水作为进水，逐步促进污泥适应新水质特征至出水处理效果稳定。实验期间，每天对进水和各反应池出水水质进行检测。

COD采用重铬酸钾法，NH₄⁺-N采用纳氏试剂分光光度法，TP采用钼酸铵分光光度法，污泥浓度（MLSS）利用恒重法，pH采用玻璃电极法，温度使用水温计法，溶解氧采用LDOTM便携式溶解氧仪进行测量。

（1）样品的采集及预处理。在每个实验阶段末各反应池均已稳定运行时进行取样，污泥样品分别取自多级AO工艺反应器的缺氧一号池、好氧一号池、缺氧二号池、好氧二号池、缺氧三号池、好氧三号池，分别记为A1、O1、A2、O2、A3、O3，各反应池取100 mL混合液，静置沉淀30 min，去除上清液，采用循环水真空泵装置进行抽滤，至滤膜上有明显覆盖物后，收集滤膜置于冻存管中于-80 ℃冰箱保存，以备DNA提取。污泥样品中的DNA采用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit提取试剂盒提取。将采集的污泥样品冷冻运送至上海美吉生物医药科技有限公司，并委托其进行Illumina MiSeq高通量测序。

（2）微生物多样性分析。实验采用PLS-DA分析对微生物进行多样性分析，即偏最小二乘法判别分析，是多变量数据分析技术中的判别分析法，经常用来分类和判断多变量数据的判别分析法。通过对主成分适当的旋转，PLS-DA可以有效地对组间观察值进行区分，能够找到导致组间区别的影响变量，使微生物种群的差异性清晰具体地展现。

对分段进水多级AO反应器各反应池进行水质指标监测，采用不断提高系统进水中原水比例的方法，促使之前培养的污泥不断适应新水质特征，并逐步达到稳定的出水处理效果，驯化实验共历时77 d，间隔一定时间提高一次进水比例直至完全以酿造废水作为进水，原水进水比例与系统COD、TP、NH₄⁺-N去除效果的关系如图 2所示。

由图 2可知，进水使用100%的模拟配水（原水为0）作为进水时，进水成分较稳定，进水浓度变化不大且COD多为可降解有机物，因此系统出水效果比较好，此时出水COD、TP、NH₄⁺-N分别为30.86、2.21、10.00 mg/L，去除率可达97.34%、93.32%、84.24%左右。由于原水进水比例较小，系统整体去除率较高且去除率比较稳定。添加原水比例为30%时，此时系统受到一定程度的冲击，反应器出水浓度增加，去除率略有降低，此时出水COD约为50.67 mg/L，TP约为2.67 mg/L，NH₄⁺-N约为13.05 mg/L，此阶段约20 d达到稳定。后逐步提高原水进水比例至70%后，此阶段稳定运行后出水COD升至53.92 mg/L左右，系统虽然也在一定程度上受到冲击，但系统的COD去除效果依旧良好，受冲击程度较弱，此时TP、NH₄⁺-N去除率分别为90.03%、72.00%，出水约为3.00、17.91 mg/L，由于该阶段进水不稳定，进水产生明显波动，此时系统受到的冲击较大，但系统出水水质和去除率皆较稳定，说明反应器系统具有较强的抗冲击能力，状态恢复得比较快，系统对TP、NH₄⁺-N的去除性能较稳定。在最后一阶段进水完全为酿造废水，进水COD在628.38 mg/L左右，出水在58.22 mg/L左右，去除率稳定在90%以上，与模拟的酿造废水相比，COD去除率由95.14%降低至90.72%，在100%进水模式下酿造废水中除了溶解性有机物以外，还有一部分悬浮性有机物，与模拟废水中的小分子可溶性有机物相比，这部分有机物属于难降解的大分子有机物，在出水COD中这一部分未被处理的污染物导致浓度一定程度的增加，因此，平均去除率下降到90.72%左右。虽然原水占比增加，但反应器抗冲击能力较强，出水COD较稳定，依然可以达到《发酵酒精和白酒工业水污染物排放标准》（GB 27631—2011）中的要求。此时TP出水在3.59 mg/L左右，去除率平均保持在89.09%，氨氮出水达18.11 mg/L，去除率稳定在71.65%左右，TP、NH₄⁺-N出水不能达到白酒酿造废水的排放标准，后续需要进一步深度处理才能使废水达标排放。

使用IIIumina高通量测序技术从微生物层面研究分段进水多级AO工艺中污染物的去除途径，并对四种进水模式下各级反应池活性污泥样品中的微生物菌群进行Alpha多样性水平分析，分析结果如表 1所示。菌群覆盖度指数（coverage指数）用于指示本次测序相对于整体样本的覆盖度，值越高，覆盖度越高^〔5〕，实验中24个样品覆盖率均在99%以上，该结果表明本次测序数据可靠性极高。在97%相似度下，样本中的优质Tags进行类聚，共得到1 730个OTUs。

Chaol指数用于指示群落丰富度，Shannon指数与Simpson指数指示群落的多样性，Shannon指数越大，说明群落多样性越高，Simpson指数值越大，说明群落多样性越低^〔6〕。分析结果可知，随着原水进水比例的增加，原水比例越大，Chaol指数越大，表明反应器的群落丰富度越高。而Shannon指数随着原水进水比例的增加而减小，Simpson指数随着原水进水比例的增加而增加，表明反应器群落多样性呈现逐步降低的趋势。原水在进水比例为0时，Chaol指数在多级AO反应器缺氧段中总体较高，表明缺氧段的物种丰富度比好氧段高，在每组样品中，随着反应的进行，水质逐渐改善，Chaol指数总体呈现逐渐下降的趋势。而缺氧段的Shannon指数低于好氧池，Simpson指数高于好氧池，则整个反应器中好氧段的多样性较缺氧段高，造成上述结果的原因可能是在缺氧和好氧两种不同运行条件下，各个反应池微生物的生态系统有所差异^〔7〕。实验表明，多级AO工艺可以对COD、TP有很好的去除效果，当反应器各级反应池微生物多样性及丰富度存在差异性时，随着各级进水水质成分的不同，作用菌群呈现差异性。

在细菌门水平上，分段进水多级AO反应器中四组样品：0（A1、O1、A2、O2、A3、O3）；30%（A1_2、O1_2、A2_2、O2_2、A3_2、O3_2）；70%（A1_3、O1_3、A2_3、O2_3、A3_3、O3_3）；100%（A1_4、O1_4、A2_4、O2_4、A3_4、O3_4）共检测到丰富类群（平均相对丰度≥1 %）的门类主要有7个，如图 3所示。

其中，Proteobacteria、Actinobacteriota、Patesciba- cteria、Bacteroidota、Chloroflexi、Frimicutes和Acido- bacteriota在各样本中为主要菌群，Acidobacteriota是原水进水比例为0时独有的门类，这7个门类在各阶段占整体测序细菌总量的97%~99%，Sijia MA等^〔8〕发现在采用不同工艺处理焦化废水时，通过测序分析活性污泥中微生物群落，其主要优势菌门为Proteobacteria、Bacteroidota、Chloroflexi和Frimicutes，除相对丰度有所不同外，其微生物多样性不随处理工艺的改变而产生差异性，与本研究结论一致。

Proteobacteria数量最多，占总丰度的26.20%~ 51.93%，是该工艺的第一优势菌门，自然界中一些反硝化细菌和大多数固氮细菌基本都属于该门类，在水处理工艺中占主要地位，这与黄潇^〔9〕、DongdongYE等^〔10〕分别应用多级AO工艺和A²O工艺处理城市生活和酱油废水的研究结果一致。反应器中Patescibacteria的相对丰度为9.37%~46.08%，其在30%、70%和100%的配水模式下是反应器的第二优势菌门，Patescibacteria具有超小的细胞形态和简化的膜结构，有利于增加代谢率^〔11〕，促进水体环境中有机物的分解，提高去除率^〔12〕。Actinobacteriota好氧时可吸磷，具有多样化的次级代谢，厌氧时可降解氨基酸等有机物^〔13〕。Actinobacteriota相对丰度在100%进水模式下A2池最大为20.80%，30%进水模式下A2池丰度最小为8.28%，在各反应池单元，其相对丰度差异性较小。Bacteroidota平均丰度为10.36%，具有重要的硝化及反硝化除磷作用，总氮和总磷的去除率与其丰度大小呈正相关^〔14〕。酿造废水中杂环类大分子含量较多，Chloroflexi的存在有利于大分子难降解物质的去除^〔15〕。Frimicutes的相对丰度为2.76%~12.73%，Frimicutes可降解COD和乳酸等，属于革兰氏阳性菌^〔16〕。Acidobacteriota可以降解植物残体、参与单碳化合物降解，是四种进水模式下仅有的仅出现在0进水模式下的优势菌门，其在该模式下的相对丰度为0.36%~1.12%，平均丰度为0.79%，酿造废水原水含有大量复合型有机物，随着原水的添加，Acidobacteriota需求降低，功能减弱，故其丰度减小，不再属于优势菌门。吴晓斐等^〔17〕在研究不同处理梯度污水对细菌群落和酶活性的影响时发现，污水灌溉可以抑制酸杆菌门的活性，这与本研究结果相似。

本次测序24个样本共检出菌属420个，其中相对丰度大于1%的细菌属有28个，占细菌总量的79.06%~86.56%，属水平下各池微生物群落相对丰度如图 4所示。

已知属中Candidatus-competibacter、Propionici-cella、Terrimonas、Tessaracoccus、Thiothrix和Hypho-microbium的相对丰度较高，其丰度分别为7.86%~ 31.65%、3.10%~8.75%、1.41%~7.95%、2.46%~11.14%、2.10%~3.24%、1.51%~2.86%，未知菌属（Unclassifi- ed）在各池的占比为5.27%~16.34%%，norank在各池的占比为18.61%~49.39%。反应器各池优势菌属相同，相对丰度不同，表明不同处理单元的细菌种群组成相似，微生物群落结构较为稳定。污水处理过程中活性污泥经缺氧一号池（A1）、好氧一号池（O1）、缺氧二号池（A2）、好氧二号池（O2）、缺氧三号池（A3）和好氧三号池（O3）进入二沉池又部分回流至缺氧一号池（A1）形成一个完整的循环体系，因此在各反应单元微生物种群组成相似，但在各个处理单元中占据优势功能作用的微生物所占比例略有不同，LEI Zhang等^〔18〕对AAO工艺处理系统中3个处理单元微生物群落结构进行分析，其结果与本实验相似，3个处理单元优势菌属相同，微生物群落演替不明显，只有比例上的差异。

在已知菌属中，Candidatus-competibacter是污水处理中的重要细菌，它们可以将水中的氨氮转化为氮气去除，促进氮循环的进行，利用Candidatus-competibacter进行生物强化，可能是提高高氮废水去除率的有效途径。在高春娣等^〔19〕的研究中，Candi-datus-competibacter被认为是有利于污泥沉降的微生物菌属。与何嘉鹏^〔20〕的实验结果不同，本实验中Nitrosomonas、Nitrospira作为硝化细菌的重要菌属虽被检出，但丰度皆小于1%，被归类为其他菌属（others）在图中表示。Propionicicella的相对丰度为3.10%~8.75%，是一种能够在温度为15~37 ℃，pH为4.5~8.5优势生长的厌氧细菌，该菌株在氯溶剂生物降解中具有重要作用，能够在浓度非常高的氯盐剂存在的情况下发酵，与脱氯剂进行联合产生相互作用，进而降低氯含量。Terrimonas属于Bacteroi- detes的鞘脂杆菌纲^〔21〕，能进行好氧反硝化作用的菌属^〔22〕，有利于提高反应脱氮效率。本研究中的六个处理单元中，Terrimonas比例在1.41%~7.95%，这表明在整个分段进水多级AO处理工艺中，Terrimonas是承担反硝化功能的主要菌属。Tessaracoccus的相对丰度为2.46%~11.14%，来自Actinobacteria门，它是一种革兰氏阳性的兼性厌氧菌，不能运动且不产孢子。Thiothrix 作为一种能以硫化物为唯一能源生长的菌属，被认为是造成活性污泥膨胀的主要原因之一^〔23-24〕。而本研究过程中未见明显的污泥膨胀现象，在HRT、温度、进水水质等条件相同的情况下，Thiothrix 在缺氧池的相对丰度略大于好氧池，故缺氧池发生污泥膨胀的可能性要大于好氧池。Hypho-microbium的总体相对丰度较低，为1.51%~2.86%，其是好氧反硝化菌生丝微菌属，是好氧反硝化菌的代表，能在好氧条件下将氨氮直接转化为气态最终产物。

采用PLS-DA比较了四种原水比例进水模式下微生物组成的差异性，如图 5所示。

同一进水模式下的6个反应器样本聚集明显，说明同种进水模式下的6个反应池之间的物种组成相似，而0与100%两种进水模式下微生物种群具有十分明显的差异性。且从同种进水模式的6个组内样品来看，0进水模式下反应池内的微生物差异性要比70%进水模式下低，这说明70%进水模式时反应器内部的微生物种群更加多样化，这种优势从微生物层面反应了当原水比例大时，与配水模式相比，由于进水水质成分更复杂，使得反应器生态系统为适应新的水质特征而随之变化，反应器内部的微生物群落组成也相应变得多元化。从图 5可以看出，在同一进水模式下的A池和O池样品的微生物群落结构组成非常相似，并未因溶解氧的显著不同而表现出明显差异，通常在每个处理单元中，在不同的环境条件下会形成不同的微生物群落结构。但是，由于有回流系统，微生物在每个处理单元中循环，因此在相同进水运行模式下各反应池微生物组成大体相似只在种类丰度上受环境因子的影响表现出不同。

表 2为门水平和纲水平上四种进水模式下丰度具有显著差异的物种统计表。

在四组进水模式下反应池内按该Proteobacter- ia丰度平均值由大到小依次是0（47.61%）＞30%（35.79%）＞100%（34.84%）＞70%（32.27%），随着原水进水比例的增加反应器内的该菌门的相对丰度占比明显降低。当原水进水比例增加，进水水质状况变复杂，为了适应新的水质条件，反应器内微生物组成也随之进行演替变化，例如增加擅长有机物的分解、可以提高代谢的Patescibacteria菌和有利于COD降解的Frimicutes菌丰度以适应复杂的进水水质，提高去除效率，由此变形菌门丰度降低，这也可能是随着原水增加反应器脱氮效果减弱的原因之一。在30%、70%和100%三种进水模式下，Patescibacteria取代Actinobacteriota成为丰度第二高的优势菌门，可能是由于原水水质条件复杂，酿造废水内含有不同的有机物组分，随着原水进水比例的增加，有机物增加，反应器内微生物群落系统提高Patescibacteria丰度有利于增加代谢率，促进水体环境中有机物的分解，提高去除效率。Acidobacteriota活性受废水进水影响，废水进水增加降低其对有机物的分解作用，丰度降低。

当原水进水比例增加至30%时，在纲水平群落结构中出现了新的微生物种群Gracilibacteria，平均丰度为6.97%，Gracilibacteria被发现是盐碱地里的一类重要菌门，其在宿主共生和寄生方面具有重要意义^〔25-26〕。当原水进水比例达100%时，出现新的菌纲Kapabacteria，其最高丰度为1.33%，最低丰度为0.10%，平均丰度为0.51%，V. V. KADNIKOV等^〔27〕研究发现Kapabacteria可能会参与相关硫酸盐还原和细胞色素代谢氧化的过程。

（1）随着原水进水比例的增加，反应器各出水指标均呈现出不同程度的增加，其中TP、NH₄⁺-N在原水添加比例为70%时受波动最大，去除效果均有明显的降低，但随着原水的进一步增加，其去除效果受影响程度减弱，出水稳定；COD受影响最小，去除率均在90%以上，且均可达到排放标准，可见虽然原水占比增加，但反应器抗冲击能力较强，出水较稳定。

（2）门水平下四种进水模式的微生物组成大致相同，其中变形菌门（Proteobacteria）、帕贝西菌（Pa- tescibacteria）和放线菌门（Actinobacteriota）数量最多，是该工艺的优势菌门，在水处理工艺中占主要地位；而酸杆菌门（Acidobacteriota）是原水进水比例为0时独有的门类，有利于单碳化合物降解，原水添加后生态环境改变，其不再属于优势菌门。

（3）属水平上，Candidatus-competibacter、Propio-nicicella、Terrimonas、Hyphomicrobium为四种进水模式下的主要菌属，四种进水模式下，微生物菌群种类类似，丰度差异较大，说明微生物菌群结构受水质冲击影响较大。