银作为一种常见的重金属及贵金属，广泛应用于冶金、化工及生物医药等行业^〔1〕。实现对工业废水中银离子的高效分析，对银离子的定量回收及环境监测具有重要的指导意义。目前检测银离子的方法主要有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、紫外可见分光光度法、电感耦合等离子体质谱法以及电化学法等^〔2-3〕。这些方法对于一定浓度范围内的银离子检测，具有较好的稳定性和可靠性。然而，对于浓度极低的银离子检测，其灵敏度和特异性难以达到要求。此外，上述方法大都依赖于昂贵的精密仪器及专业的操作人员，且需要有复杂的样本前处理过程，使银离子实时、高效、高灵敏分析受到一定的限制。

近年来，基于纳米材料独特的光学特性及与功能核酸之间的相互作用等特点而开发的生物化学传感器显示出了巨大的应用潜力^〔4〕。例如，具有良好水溶性和生物相容性的氧化石墨烯，其六元碳环通过与碱基之间的π-π电子堆积作用可吸附单链核酸分子，且能够通过能量转移过程猝灭荧光信号^〔5〕。基于氧化石墨烯的多种优势，一系列生物化学传感器被开发并应用于核酸、蛋白及离子等物质的检测^〔6-10〕。此外，具有金属离子特异性识别的功能核酸（核酸分子因其碱基与金属离子形成稳定的配位复合物而识别特定金属离子，如T—Hg²⁺—T，C—Ag⁺—C等），也因其易合成、修饰等特点而被设计成为金属离子检测传感器中的分子探针，应用于金属离子的特异性分析^〔11-15〕。

本研究结合功能核酸和氧化石墨烯（GO）的基本特点，设计并合成了含C碱基的荧光标记核酸分子探针。基于氧化石墨烯吸附单链核酸分子探针以及猝灭荧光的性质而降低背景信号；在银离子的存在下，单链核酸探针因形成C—Ag⁺—C复合结构而解离氧化石墨烯表面并恢复荧光信号；进一步，在核酸酶（DNase I）的作用下，完成银离子的循环反应，通过荧光信号的累积实现银离子的高灵敏度、高特异性检测。

用于银离子检测的核酸传感器设计过程基于以下几点理论：（1）通过π-π共轭作用以及能量转移过程，氧化石墨烯能吸附单链核酸分子，不吸附双链核酸分子，且能够猝灭其表面的荧光分子信号；（2）C—Ag⁺—C复合结构具有高度稳定性以及对Ag⁺具有良好的选择性；（3）DNase I能够降解DNA分子，但氧化石墨烯能够保护其表面吸附的单链DNA分子不被降解。具体的工作原理如图 1所示：C链DNA探针的一端修饰有FITC荧光染料，该荧光探针在溶液体系中能够发出强烈的荧光信号。体系中加入氧化石墨烯后，单链荧光探针吸附在氧化石墨烯表面，荧光信号发生“turn on”到“turn off”的变化。在体系中引入银离子后，C—Ag⁺—C复合结构的形成导致荧光探针解离氧化石墨烯表面，荧光信号再次由“turn off”转换到“turn on”模式，从而实现银离子的检测分析。进一步，在体系中加入DNase I，该酶降解C—Ag⁺—C复合结构中的荧光核酸分子探针，释放银离子并参与到下一个循环反应中，通过大量荧光信号的累计以实现银离子的高灵敏检测，并进一步用于工业废水中银离子的分析。

材料：氧化石墨烯分散液购于南京先锋有限公司；DNase I购于NEB公司（北京）；荧光修饰的DNA分子探针购于生工生物工程（上海）股份有限公司；缓冲溶液体系为自配制的1×TAE缓冲液成分及25 mmol/L镁离子；DEPC水购于宝生物工程（大连）有限公司；实验中用到的所有分析纯化学试剂均购于国药集团有限公司；银离子储存液通过溶解硝酸银于超纯水而配制；实际含银工业废水水样来源于温州福达合金有限公司外排废水样品，武汉本地自来水样品。

仪器：MilliQ纯水机（18.2 MΩ·cm，赛默飞世尔科技公司）；荧光光谱仪（F97 Pro，上海棱光）；数显恒温水浴锅（HH-2，金坛市盛蓝仪器制造有限公司）；电子天平（ML204T/02，梅特勒托利多国际贸易公司）；标准pH计（UB-7，美国丹佛仪器有限公司）；台式高速离心机（TG16-WS，湘仪离心机仪器有限公司）。

分别取5 μL不同浓度的氧化石墨烯分散液于45 μL含有终浓度为1×TAE缓冲液、25 mmol/L镁离子以及1 μmol/L的核酸分子探针（DNA）的混合溶液中。将以上溶液混合均匀后放置在水浴锅中（30 ℃）静置10 min，最后将上述反应液转移至微量比色皿并放置于荧光光谱仪中，测量并记录每种氧化石墨烯浓度下的荧光强度数据。通过对数据的分析探索氧化石墨烯猝灭荧光的能力，并优化出实验体系所需的最佳氧化石墨烯浓度。

通过体系中氧化石墨烯和DNase I加入顺序的不同，探索氧化石墨烯对DNase I降解DNA的影响。取两支1.5 mL离心管，离心管1的加样顺序（体系1）：5 μL缓冲溶液，30 μL去离子水，5 μL DNA探针，5 μL DNase I，将上述溶液混合均匀后放置在水浴锅中（37 ℃）反应30 min后，再向体系中加入5 μL氧化石墨烯分散液，再次将溶液混合均匀后放置在水浴锅中（30 ℃）静置10 min后，用荧光光谱仪记录相应产物的荧光强度。离心管2的加样顺序（体系2）：5 μL缓冲溶液，30 μL去离子水，5 μL DNA探针，5 μL氧化石墨烯分散液，将上述溶液混合均匀后放置在水浴锅中（30 ℃）静置10 min后，再向体系中加入5 μL DNase I，再次将溶液混合均匀后放置在水浴锅中（37 ℃）反应30 min后，用荧光光谱仪记录相应产物的荧光强度。通过比较两管产物的荧光强度，分析氧化石墨烯对DNase I降解DNA的影响。

Ag⁺的催化放大反应发生在总体积为50 μL的水相反应体系中，其中包括有1×TAE反应缓冲液、25 mmol/L Mg²⁺、1 μmol/L DNA探针、25 μg/mL氧化石墨烯分散、不同浓度的Ag⁺以及50 μg/mL DNase I。将反应混合物在37 ℃的水浴锅中孵育30 min后，95 ℃ 5 min终止反应。用荧光光谱仪记录相应产物的荧光强度，设置荧光激发波长为470 nm，发射波长为495~650 nm，狭缝宽20 nm，增益600 V。

氧化石墨烯浓度的选择是影响传感体系效应的重要因素之一。因为较小浓度的氧化石墨烯体系不足以猝灭所有的荧光核酸分子探针，导致传感体系较高的背景信号；但浓度过大的氧化石墨烯体系阻碍荧光信号的恢复，导致传感体系较小的实验信号响应。按2.2.1进行实验，结果见图 2。

由图 2可知，随着氧化石墨烯浓度的增大，氧化石墨烯与探针上荧光基团之间的能量转移作用变强，导致探针的荧光强度急剧下降。当石墨烯的质量浓度达到35 μg/mL时，大部分的荧光都被猝灭掉，但是当质量浓度达到50 μg/mL时，反应更为彻底。为了得到传感体系最佳的信噪比，反应体系的最优氧化石墨烯质量浓度为50 μg/mL。

在水相溶液中，DNase I能够高效降解游离的DNA分子。为验证DNase I能否高效降解吸附在氧化石墨烯上的单链核酸分子按2.2.2进行了实验，结果见图 3。

由图 3可知，体系1的荧光强度大于体系2的荧光强度，说明DNase I能够有效降解游离的DNA分子，降解氧化石墨烯表面的DNA分子的能力较弱。

根据传感器的设计思路，进行了一系列的验证实验，设计了以下体系并记录相应的荧光强度。体系1’，缓冲溶液，DNA核酸分子探针；体系2’，缓冲溶液，DNA核酸分子探针，氧化石墨烯；体系3’，缓冲溶液，DNA核酸分子探针，氧化石墨烯，银离子；体系4’，缓冲溶液，DNA核酸分子探针，氧化石墨烯，银离子，DNase I；体系5’，缓冲溶液，DNA核酸分子探针，氧化石墨烯，银离子，Cl^-。实验结果见图 4。

由图 4可知，游离的DNA核酸分子探针荧光强度大；加入氧化石墨烯后，荧光信号急剧下降；加入银离子后，荧光信号有所增加；加入Dnase I后，荧光信号进一步加强；加入Cl^-后，形成AgCl沉淀，阻碍C—Ag⁺—C结构的形成，荧光信号弱。该实验结果验证了实验思路的可行性。

在检测工业废水中银离子含量之前，需要有标准曲线的参照。因此，配制了不同浓度系列的银离子标准品，通过检测并记录不同标准品的加入而引起传感体系的荧光信号强度变化，分析以上实验数据并绘制标准曲线。根据标准曲线以及待测样品的荧光信号强度，可计算待测样品的银离子浓度。实验结果如图 5所示。

由图 5可以看出，随着Ag⁺浓度增大，荧光强度逐渐增强，Ag⁺浓度从0.5 nmol/L增加到500 nmol/L时，荧光强度呈指数曲线增大变化，并且在0.5~20 nmol/L之间，具有良好的线性关系（R²=0.998 7）。以上实验结果表明该传感体系对银离子有较宽的响应范围，可应用于工业废水等环境样本中Ag⁺的定性及定量分析。此外，根据3倍多次空白的标准偏差，得出该方法的检测限为0.5 nmol/L。该方法因引入了银离子的循环反应，使其检测限相较于传统的方法较低（传统方法的检测限为μmol/L级别），实现了银离子的高灵敏检测。

作为一种有效的金属离子分析体系，能够特异性识别目标离子具有重要的实践意义。为了验证传感体系的特异性，将与环境相关的金属离子，其中包括有Ag⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺等，替代原体系中的银离子，且替换的金属离子的浓度均是银离子浓度的100倍，保持其他实验条件不变，分别测量并记录每种金属离子体系的荧光信号强度。结果，除了Ag⁺外，其他金属离子的响应信号均很低，说明该方法对Ag⁺具有特异性检测的能力。

为了验证该传感体系检测Ag⁺的适用性和可靠性，收集了温州福达合金有限公司外排废水样品以及武汉自来水样。首先，对收集回来的水样直接用于Ag⁺的检测。另外，在原始样本中掺杂不同10、100 nmol/L的Ag⁺，再根据之前的步骤对其进行检测，每次检测至少进行3次平行试验，取其平均值，并计算标准偏差。结果如表 1所示。

由表 1可知，在自来水样中没有检测到Ag⁺，工业排水中测得的Ag⁺浓度为58.9 nmol/L；向实际样本中分别掺杂10、100 nmol/L的Ag⁺，得到了99.2%~101.6%之间的加标回收率；每个样本多次平行试验的标准偏差在0.001~0.009之间；该统计结果说明该传感体系能够有效用于实际环境水样（工业废水）中Ag⁺的追踪分析。

本项目利用荧光核酸分子探针以及氧化石墨烯的特点，针对银离子分析目的，设计了基于氧化石墨烯的核酸传感器并应用于银离子的高效检测。通过一系列的实验结果验证了该传感器的可行性和合理性。该体系有望实现对工业排水中的银离子进行高灵敏分析，能在nmol/L级范围内检测到银离子，真正可以实现银离子的零排放，为环境中重金属离子的检测提供新的思路和方法，为企业创造经济价值。