除锰细菌的分离鉴定及其固定化除锰研究

doi:10.19965/j.cnki.iwt.2022-0438

除锰细菌的分离鉴定及其固定化除锰研究

尹思雨^,¹^,², 黄磊¹^,², 党俊杰¹^,², 邓冬梅^,¹^,²

1.广西科技大学生物与化学工程学院, 广西柳州 545006

2.广西糖资源绿色加工重点实验室, 广西柳州 545006

Isolation and identification of manganese removal bacteria and study on its manganese removal by immobilization

YIN Siyu^,¹^,², HUANG Lei¹^,², DANG Junjie¹^,², DENG Dongmei^,¹^,²

1.College of Biology and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China

2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources，Liuzhou 545006，China

收稿日期: 2023-01-06

基金资助:

广西省自然科学基金项目.  2017GXNSFBA198099
广西研究生教育创新计划项目.  GKYC202014
大学生创新创业项目.  202110594049

Received: 2023-01-06

作者简介 About authors

尹思雨（1998—），硕士研究生E-mail：Missyyin@126.com , E-mail：Missyyin@126.com

邓冬梅，副教授，博士E-mail：deng-dongmei@163.com , E-mail：deng-dongmei@163.com

摘要

自含锰土壤中筛选得到2株具有除锰能力的革兰氏阳性菌S1、S2，比对16S rRNA序列结果，推测2株细菌可能为巨大芽孢杆菌（Baciulls megaterium）和嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。在质量浓度为260 mg/L的Mn²⁺培养基中培养6 d后，2株细菌对Mn²⁺的去除率均可达95%以上。扫描电镜能谱（SEM-EDS）分析、X射线衍射（XRD）分析表明这2株细菌是通过将Mn²⁺转化为MnCO₃实现对Mn²⁺的去除。采用海藻酸钠和活性炭作为包埋剂将菌体制成固定化微胶囊，在含锰废水Mn²⁺质量浓度为150 mg/L时胶囊固定菌的除锰率远高于游离菌相应的值，利用正交实验优化胶囊固定菌的除锰条件后菌株的除锰率均高于96%，3轮循环除锰实验后胶囊固定菌仍有较好的除锰率，可见胶囊固定菌具备一定的重复利用性能。

关键词： 除锰细菌 ; 包埋固定化 ; 含锰废水 ; 正交实验

Abstract

Two Gram-positive bacteria S1 and S2 with manganese removal ability were screened from manganese-containing soil，and the comparison of 16S rRNA sequences showed that the two bacteria might be Baciulls megaterium，Stenotrophomonas maltophilia. The removal rate of Mn²⁺ could reach more than 95% after 6 days of culture in the medium with the mass concentration of Mn²⁺ of 260 mg/L. Scanning electron microscopy energy dispersive spectroscopy （SEM-EDS） and X-ray diffraction （XRD） analysis showed that the two bacteria could remove Mn²⁺ by transforming Mn²⁺ into MnCO₃. Sodium alginate and activated carbon were used as embedding agents to prepare immobilized microcapsules，when the mass concentration of Mn²⁺ in manganese-containing wastewater was 150 mg/L，the manganese removal rates of capsule-immobilized bacteria were much higher than those of free bacteria. The manganese removal rates could reach 96% after optimizing the manganese removal conditions of immobilized bacteria in capsules by orthogonal test. After three rounds of circulating manganese removal experiments，the immobilized bacteria in capsules still had a good manganese removal rates. It could be seen that the immobilized bacteria in capsules have certain reusability.

Keywords： manganese-removing bacteria ; embedding immobilization ; manganese-containing wastewater ; orthogonal test

PDF (3102KB) 元数据多维度评价相关文章导出 EndNote| Ris| Bibtex 收藏本文

本文引用格式

尹思雨, 黄磊, 党俊杰, 邓冬梅. 除锰细菌的分离鉴定及其固定化除锰研究. 工业水处理[J], 2023, 43(3): 172-180 doi:10.19965/j.cnki.iwt.2022-0438

YIN Siyu. Isolation and identification of manganese removal bacteria and study on its manganese removal by immobilization. Industrial Water Treatment[J], 2023, 43(3): 172-180 doi:10.19965/j.cnki.iwt.2022-0438

锰是人体必需的微量元素，但若长期过量摄入锰则会导致慢性中毒。工业生产和矿产资源的开发导致含锰废水被排放到环境中，对人类和环境产生危害，因此对于锰污染废水的治理十分必要^〔1〕。微生物法可利用除锰微生物去除水体中的锰，是近年来研究较多的水体锰污染治理方法^〔2〕。

除锰微生物主要通过2种方式去除锰：（1）具有锰氧化能力的微生物将可溶性的Mn²⁺催化氧化为不可溶的高价锰氧化物^〔3〕；（2）部分细菌虽不能氧化Mn²⁺生成高价锰氧化物，但可以将Mn²⁺富集到菌体表面，在周围环境的作用下生成不溶的MnCO₃^〔4〕，从而达到去除水中金属锰的效果。固定化是将细菌用于实际废水处理的手段之一，包埋法是固定化方法中较常用的一种^〔5〕，包埋法能使集中在其内部的微生物保持较高的活性，包埋形成的小球机械强度大且能抵御一定的水力冲击^〔6〕，在地下水处理和自来水净化中应用较多。然而，包埋法固定除锰细菌处理的大多是低浓度锰离子废水，本研究拟在对除锰细菌进行筛选鉴定和除锰特性研究基础上，利用正交实验探讨固定化细菌的最佳除锰条件和最适Mn²⁺浓度，以期为微生物除锰新型菌种的开发和固定化技术理论研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种来源及培养基的制备

1.1.1 菌种来源

菌种筛选自桂林市大新锰矿区周边的土壤。含Mn²⁺的工业废水取自柳州市桂柳化工厂，废水COD为50 mg/L，实际含Mn²⁺质量浓度为29 mg/L，实验中通过添加硫酸锰改变Mn²⁺质量浓度。

1.1.2 培养基的制备

无Mn²⁺液体培养基配方：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏3 g/L，氯化钠5 g/L，pH=6.5。

含Mn²⁺液体培养基配方：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏3 g/L，氯化钠5 g/L，MnSO₄·H₂O适量，pH=6.5。

无Mn²⁺固体培养基的配方为在无Mn²⁺液体培养基基础上添加20%琼脂，含Mn²⁺固体培养基的配方为在含Mn²⁺液体培养基基础上添加20%琼脂。

以上无Mn²⁺培养基均需用高压灭菌锅于121 ℃下灭菌30 min；此外，在超净台下用已灭过菌的0.22 μL过滤器对MnSO₄·H₂O进行过滤除菌，加入无Mn²⁺培养基制备含Mn²⁺培养基。

1.2 锰氧化菌株的分离纯化

取含锰泥土10 g加入到90 mL灭菌生理盐水中充分振荡10 min^〔7〕，静置5 min后取上清液5 mL接种到100 mL含Mn²⁺的液体培养基中，在30 ℃、转速120 r/min条件下培养48 h，梯度稀释后涂布在含Mn²⁺平板上于30 ℃培养48 h，挑取单菌落多次划线分离得到耐锰纯菌种。

用亮柏蓝（Leucoberbelin blue，LBB）试剂进行高价锰离子的检测，以检验纯化得到的菌株是否具有锰氧化活性^〔8〕。配制Mn²⁺质量浓度为260 mg/L的培养基，将菌株按1%的接种量接种到培养基并培养5 d；取1 mL菌液离心，倒掉上清液，在沉淀中加入1 mL 45 mmoL/L乙酸和0.5 mL质量分数为0.04%的LBB，摇匀后静置一段时间，观察液体颜色的变化。

1.3 除锰细菌的鉴定

1.3.1 形态观察

对筛选出的菌株进行划线分离，采用革兰氏染色法观察单菌落的形态特征，包括菌落的颜色、大小、形状等^〔9〕。

1.3.2 16S rRNA基因序列分析

利用细菌鉴定的特异性通用引物27F和1492R对菌液进行16S rRNA基因的PCR片段扩增^〔8〕。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用CW2302A快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（康为试剂生物科技有限公司）纯化PCR产物。将纯化的DNA寄送测序；将测序获得的16S rRNA基因序列在GenBank数据库中通过BlastN程序进行相似序列的搜索对比，再运用MAGE 7.0软件^〔10〕进行同源比对，构建系统发育进化树。

1.4 菌株生长及Mn²⁺去除特性研究

考察菌株的生长情况并对其Mn²⁺去除特性进行研究。将菌株以1%的接种量接种到Mn²⁺质量浓度分别为0、130、260、488、814 mg/L的200 mL液体培养基中，在120 r/min、30 ℃条件下培养6 d，间隔一定时间取样测菌液pH。另取1 mL菌液离心，取上清液在450 nm处测定其吸光度，计算培养基中剩余的Mn²⁺得到Mn²⁺去除率。

1.5 菌株表面锰化合物的表征分析

通过X射线衍射（XRD）^〔11〕、扫描电镜-X射线能谱分析（SEM-EDS）^〔12〕等分析方法对细菌表面锰化合物的表观特征进行分析。

将菌株接种到含Mn²⁺的液体培养基中培养5 d，在6 000 r/min转速下离心5 min，倒掉上清液，用无菌水清洗菌体数次，倒掉上清液，放入冰箱冷冻，完全结冰后，用真空冷冻干燥机干燥直至成粉末，压片处理后，在管电流40 mA、管电压40 kV、扫描速度5（°）/min、2θ扫描范围10^o~80^o条件下进行XRD衍射测定。

将菌株接种到含Mn²⁺的液体培养基中培养5 d，在6 000 r/min转速下离心5 min，倒掉上清液，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗菌体3次，加入2.5%的戊二醛混匀后放入冰箱固定24 h。之后用不同浓度的酒精对其进行梯度脱水，每次脱水10 min，离心后弃去上清液，脱水完毕真空干燥直至菌体成粉末，喷金处理后用扫描电子显微镜进行SEM观察和EDS能谱分析。

1.6 胶囊固定菌的制备

参照文献〔13〕中海藻酸钠-壳聚糖-粉末活性炭微胶囊的制备方法制备胶囊固定菌。以m（活性炭）∶m（海藻酸钠溶液）=0.75∶100的比例向质量分数为2%的海藻酸钠溶液加入粉末活性炭形成粉末活性炭-海藻酸钠溶液。将湿菌体与粉末活性炭-海藻酸钠溶液以1 g∶50 mL的比例充分混匀，滴入质量分数为4%的氯化钙溶液中，固定化1.5 h，得到凝胶颗粒。用纯水洗去颗粒表面吸附的钙离子，浸入质量分数为1.8%的壳聚糖溶液中成膜，再用0.055 mol/L柠檬酸钠溶液液化内核，最后浸入质量分数为0.15%的海藻酸钠溶液中覆膜，得到胶囊固定菌。将胶囊固定菌用纯水清洗3次后浸在纯水中，置于4 ℃下保存备用。

参照上述方法不添加实验菌种获得空白胶囊。

1.7 Mn²⁺去除率对比实验

在温度30 ℃、转速120 r/min条件下振荡培养菌种，经3次离心并洗涤后得到湿菌体；将1 g湿菌体用50 mL无菌生理盐水重悬制得游离菌，使用前摇匀。

调整废水中Mn²⁺质量浓度为150 mg/L，pH=6.8。将菌悬液、胶囊固定菌及空白胶囊均按1 mL∶10 g的比例接种到100 mL废水中，于温度30 ℃、转速120 r/min条件下振荡培养3 d后进行Mn²⁺去除率的测定。

1.8 正交实验

采用L₉（3⁴）正交表进行实验设计，选取培养时间（A）、pH（B）、m（活性炭）∶m（海藻酸钠溶液）（C）、Mn²⁺质量浓度（D）这4个因素，每个因素下选取如表1所示的3个水平，通过对正交实验结果进行极差分析得出优化方案，并对优化方案进行验证。

表1 正交因素水平

Table 1 Orthogonal factor level

水平	因素
水平	A/d	B	C	D/（mg·L^-1）
1	2	6.0	0.25∶100	50
2	4	7.0	0.75∶100	250
3	6	8.0	1.0∶100	500

新窗口打开| 下载CSV

1.9 重复利用实验

在优化条件下检测胶囊固定菌的除锰率。一轮降解实验结束后将胶囊固定菌过滤回收，用无菌纯水清洗3次，再次按优化条件接种至废水中培养，考察Mn²⁺去除率，重复3次。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离和鉴定

实验经分离纯化得到了2株细菌S1、S2。观察其菌落特征，并对其进行革兰氏染色、LBB实验，结果见图1。

图1

新窗口打开| 下载原图ZIP| 生成PPT

图1 S1、S2的菌落特征及其革兰氏染色、LBB实验结果

Fig.1 Colony characteristics of S1 and S2 and their Gram staining and LBB test results

由图1可知，细菌S1、S2的菌落颜色分别为棕色和米白色，均为不透明的圆形，表面凸起，为革兰氏阳性菌，长杆状，无鞭毛；菌株S1和S2均具有锰氧化活性，LBB显色结果显示菌株S1的显色较S2的深，说明菌株S1的锰氧化性高于菌株S2。

图2为基于S1、S2菌株16s rRNA序列的系统发育树。

图2

新窗口打开| 下载原图ZIP| 生成PPT

图2 基于S1、S2菌株16S rRNA序列的系统发育树

Fig.2 Phylogenetic trees based on 16S rRNA sequences of S1 and S2 strains

图2所示的菌株的16S rRNA基因序列分析结果表明，菌株S1、S2分别与巨大芽孢杆菌（Baciulls megaterium）、嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）亲缘关系最为接近，推测二者可能分别为Bacillus megaterium和Stenotrophomonas maltophilia。

2.2 菌株生长情况及Mn²⁺去除特性

图3为菌株在不同Mn²⁺浓度下的生长曲线。

图3

新窗口打开| 下载原图ZIP| 生成PPT

图3 菌株在不同Mn²⁺质量浓度下的生长曲线

Fig.3 Growth curves of strains at different mass concentrations of Mn²⁺

由图3（a）可知，S1在各Mn²⁺浓度下均生长良好，在Mn²⁺质量浓度为0、130、260 mg/L下各生长曲线形状相似，说明低浓度的Mn²⁺对S1的生长影响不大，在高浓度Mn²⁺下S1的生长速度相对减小，说明S1生长受高浓度Mn²⁺影响较大；由图3（b）可知，S2生长受Mn²⁺浓度影响较大，Mn²⁺质量浓度为814 mg/L时S2生长受到明显抑制，在其余Mn²⁺质量浓度下，Mn²⁺质量浓度越高，S2进入对数生长期的时间就越长。S1、S2均在Mn²⁺质量浓度为260 mg/L时有最大OD₆₀₀值。

图4所示为在不同Mn²⁺浓度下进行细菌培养的培养基pH的变化曲线。

图4

新窗口打开| 下载原图ZIP| 生成PPT

图4 不同Mn²⁺质量浓度下培养基pH的变化曲线

Fig.4 Change curves of medium pH at different mass concentrations of Mn²⁺

由图4可知，菌株S1、S2在6 d的培养过程中，菌液pH都呈逐步升高的状态，由最初的6.5上升到9.0以上。

图5所示为菌株在不同Mn²⁺浓度下对Mn²⁺的去除率。

图5

新窗口打开| 下载原图ZIP| 生成PPT

图5 在不同Mn²⁺浓度下菌株的Mn²⁺去除率

Fig.5 Mn²⁺ removal rates of strains at different concentrations of Mn²⁺

如图5所示，在培养时间为6 d时，S1、S2在最适生长的Mn²⁺质量浓度（260 mg/L）下有较为理想的除锰率，分别为97.94%、100%。S1在Mn²⁺质量浓度为130、260 mg/L时的除锰率明显高于在Mn²⁺质量浓度为488 mg/L时。此外，培养时间越长，菌株对Mn²⁺的去除率越高；S2在Mn²⁺质量浓度为488 mg/L下的除锰率随培养时间的增加而增大，在Mn²⁺质量浓度为130、260 mg/L时培养3 d的S2的除锰率就已接近或达到培养时间为6 d时的除锰率。

2.3 XRD与能谱分析

图6为采用含Mn²⁺和无Mn²⁺培养基培养的S1、S2的XRD图谱，表2为含Mn²⁺培养基培养的S1、S2的SEM-EDS分析结果。

图6

新窗口打开| 下载原图ZIP| 生成PPT

图6 含Mn²⁺和无Mn²⁺条件下培养的S1、S2的XRD

Fig.6 XRD patterns of S1 and S2 cultured with and without Mn²⁺

表2 S1、S2的SEM-EDS分析结果

Table 2 SEM-EDS analysis results of S1 and S2

元素种类	S1		S2
元素种类	质量分数/%	原子分数/%	质量分数/%	原子分数/%
C	25.22	43.61	20.98	35.14
N	2.76	4.09	3.53	5.07
O	26.75	34.72	35.86	45.08
Al	0.14	0.10	0.14	0.10
Si	0.12	0.09	—	—
P	0.87	0.59	0.24	0.16
S	0.29	0.19	0.21	0.13
Ca	0.28	0.14	0.10	0.05
Mn	41.87	15.83	38.94	14.26
Fe	1.71	0.64	—	—

新窗口打开| 下载CSV

由图6可知，菌株S1表面锰氧化作用产物的XRD图谱与PDF2-2004标准矿化物卡片库编号为PDF#83-1763（MnCO₃）的图谱拟合度最好，菌株S2表面锰氧化作用产物XRD图谱与PDF2—2004标准矿化物卡片库编号为PDF#99-0089（MnCO₃）的图谱拟合度最好，可判断S1、S2菌体表面产生的锰氧化物均为MnCO₃。表2能谱分析结果显示含Mn²⁺培养基培养的细菌S1、S2表面的锰质量分数都很高，分别为41.87%、38.94%，说明菌体表面有大量含锰物质。

2.4 胶囊固定菌成品

图7为胶囊固定菌外观。制备好的胶囊固定菌呈小圆球状，直径约5 mm，大小较为均匀。

图7

新窗口打开| 下载原图ZIP| 生成PPT

图7 胶囊固定菌外观

Fig.7 Appearance of immobilized bacteria in capsules

2.5 Mn²⁺去除率分析

图8为游离菌、空白胶囊、胶囊固定菌对Mn²⁺去除率的对比结果。

图8

新窗口打开| 下载原图ZIP| 生成PPT

图8 游离菌、空白胶囊、胶囊固定菌对Mn²⁺去除效果

Fig. 8 Removal of Mn²⁺by free bacteria， blank capsule and immobilized bacteria in capsules

如图8所示，经过3 d的降解，游离菌S1、S2，空白胶囊及胶囊固定菌S1、S2的平均Mn²⁺去除率分别是16.79%、21.23%、34.94%、64.07%、57.53%，空白胶囊因活性炭的吸附作用使其也具有一定的除Mn²⁺能力，胶囊固定菌的除锰率明显高于游离菌的除锰率。

2.6 正交实验分析

胶囊固定菌S1和S2的正交实验结果如表3、表4所示，表中k1、k2、k3分别代表各因素水平下Mn²⁺的平均去除率，r为极差值。

表3 胶囊固定菌S1去除Mn²⁺的正交实验结果

Table 3 Orthogonal experiment results of removing Mn²⁺ by immobilized bacteria S1 in capsule

实验序号	A/d	B	C	D/（mg·L^-1）	Mn²⁺去除率/%
因素主次	D＞C＞B＞A
1	2	6.0	0.25∶100	50	75.54
2	2	7.0	0.75∶100	250	31.48
3	2	8.0	1.0∶100	500	42.72
4	4	6.0	0.75∶100	500	50.87
5	4	7.0	1.0∶100	50	79.79
6	4	8.0	0.25∶100	250	30.97
7	6	6.0	1.0∶100	250	25.27
8	6	7.0	0.25∶100	500	39.18
9	6	8.0	0.75∶100	50	93.11
k1	49.91	50.56	48.56	82.81
k2	53.88	50.15	58.49	29.24
k3	52.52	55.60	49.26	44.26
r	3.96	5.45	9.92	53.57

新窗口打开| 下载CSV

表4 胶囊固定菌S2去除Mn²⁺的正交实验结果

Table 4 Orthogonal experiment results of removing Mn²⁺ by immobilized bacteria S2 in capsule

实验序号	A /d	B	C	D /（mg·L^-1）	Mn²⁺去除率/%
因素主次	A＞B＞D＞C
1	2	6.0	0.25∶100	50	81.00
2	2	7.0	0.75∶100	250	96.37
3	2	8.0	1.0∶100	500	85.90
4	4	6.0	0.75∶100	500	46.61
5	4	7.0	1.0∶100	50	68.29
6	4	8.0	0.25∶100	250	43.82
7	6	6.0	1.0∶100	250	35.68
8	6	7.0	0.25∶100	500	67.07
9	6	8.0	0.75∶100	50	91.79
k1	87.76	54.43	63.96	80.36
k2	52.91	77.24	78.26	58.62
k3	64.85	73.84	63.29	66.53
r	34.85	22.81	14.97	21.74

新窗口打开| 下载CSV

表3中，胶囊固定菌S1在3个时间水平下的除锰率相差不大，考虑成本及Mn²⁺去除率，S1的除锰时间定为2 d。根据pH、m（活性炭）∶m（海藻酸钠溶液）、Mn²⁺质量浓度3个因素下的最大的除锰率，其余条件定为pH=8.0、m（活性炭）∶m（海藻酸钠溶液）=0.75∶100、Mn²⁺质量浓度为50 mg/L。表4中，胶囊固定菌S2在4个因素的不同水平下均有各自最高的除锰率，所以胶囊固定菌S2的除锰条件定为时间2 d、pH=7.0、m（活性炭）∶m（海藻酸钠溶液）=0.75∶100、Mn²⁺质量浓度为50 mg/L。通过正交实验结果分析所得出的2个优化方案并不包含在正交表已经做过的9个实验方案中，体现了正交实验的优越性。

按2种胶囊固定菌各自的最优方案进行实验，得到胶囊固定菌S1的除锰率为96.33%（>93.11%），说明除Mn²⁺最佳条件组合为A₁B₃C₂D₁，即时间2 d、pH=8.0、m（活性炭）∶m（海藻酸钠溶液）=0.75∶100、Mn²⁺质量浓度50 mg/L。胶囊固定菌S2的除锰率为94.88%（<96.37%），说明除锰最佳条件组合为A₁B₂C₂D₂，即时间2 d、pH=7.0、m（活性炭）∶m（海藻酸钠溶液）=0.75∶100、Mn²⁺质量浓度250 mg/L。

在胶囊固定菌S1的最优方案A₁B₃C₂D₁及胶囊固定菌S2的最优方案A₁B₂C₂D₂下进行后续实验。

2.7 重复利用实验

胶囊固定菌S1和S2的重复利用结果见图9。

图9

新窗口打开| 下载原图ZIP| 生成PPT

图9 重复利用实验结果

Fig. 9 Reuse the experimental results

如图9所示，在最佳除锰条件下，胶囊固定菌S1、S2第1次使用时的除锰率分别为95.40%、95.73%，经3轮重复实验后胶囊固定菌的除锰率仍分别有59.73%、34.60%，说明胶囊固定菌具有一定重复利用性，且胶囊固定菌S1的重复利用性能强于S2。

胶囊固定菌S1、S2经3轮重复利用实验后，整体外观基本正常，有个别颗粒观察到轻微破损现象（＜5%），原因可能是制备及转移培养过程中导致的机械损伤或培养过程中胶囊吸水溶胀，致使球体破裂。可见，胶囊固定菌具备一定的重复利用性能，有较好的经济效益和环境效益。

3 讨论

目前，研究者已从环境中筛选出多株具有耐锰特点的芽孢杆菌。Bacillus megaterium MB2^〔14〕的最高耐Mn²⁺质量浓度为550 mg/L，但其在含Mn²⁺条件下的生长均不如无Mn²⁺条件下的生长，Mn²⁺质量浓度为660 mg/L时菌体几乎不能生长，且其在Mn²⁺质量浓度为55 mg/L的培养基中培养7 d后对Mn²⁺的去除率仅有（61.7±1.17）%；Bacillus megaterium 79^〔15〕在Mn²⁺质量浓度为55 mg/L时对数期延迟，菌体生长受到明显抑制，在高质量浓度（550 mg/L）的Mn²⁺下基本丧失了锰氧化能力。而本研究中菌株S1在0~814 mg/L的Mn²⁺质量浓度范围内生长过程基本正常，在260 mg/L Mn²⁺质量浓度下生长情况最好且有最高除锰率97.94%。

Stenotrophomonas maltophilia很少作为除锰细菌出现，但有关于Stenotrophomonas maltophilia去除重金属离子U^4+〔16〕和Cu^2+〔17〕的报道。在本研究中菌株S2作为锰氧化细菌用于重金属Mn²⁺的去除，在130~488 mg/L Mn²⁺下的最终生物量均优于无Mn²⁺条件下，Mn²⁺质量浓度为260 mg/L时S2对Mn²⁺的去除率达到了100%。

和其他重金属离子一样，高浓度Mn²⁺会通过影响细胞分裂、细胞膜通透性、细胞生理生化反应等^〔18〕对细胞生长造成抑制或毒害作用，研究表明，细菌可以通过细菌胞外分泌物、细胞表面的重金属吸附作用、胞内分子机制等^〔19〕在高浓度重金属离子环境中生长。因S1、S2都具有良好的耐锰能力，初步说明S1、S2可能具有上述一种或几种耐受机制，但具体的耐受机制还有待深入研究。

不同于大多数锰氧化细菌那样将Mn²⁺氧化为Mn⁴⁺，S1、S2这2株细菌是将Mn²⁺转化为不溶的MnCO₃。培养过程中培养基pH呈上升趋势，最高达到了9.0以上，可能是菌体在代谢过程中生成了OH^-使培养基pH增大，促进了化学反应Mn²⁺+HCO₃^-+OH^- $\overset{}{̿}$ MnCO₃+H₂O的发生^〔4〕。LBB显色实验表明细菌在培养过程中有高价锰的生成，但菌体表面化合物鉴定为MnCO₃，可能是由于生成的锰氧化物量太少而未被检测出来，也有可能是一开始生成的高价锰氧化物不稳定，在细菌培养过程中又转化为了低价锰^〔20〕。研究发现重金属离子^〔21-22〕能以络合、离子交换、螯合等方式与细菌细胞壁表面的聚合电解质（肽聚糖、蛋白质等）、活性基团（羧基、羟基等）结合，能谱分析结果显示S1、S2菌体表面有较高含锰量（41.87%、38.94%），说明除了氧化作用形成的含锰化合物之外，细菌还可能通过物理吸附和积累等作用协同去除Mn²⁺。

将筛选出的2株除锰细菌通过包埋法制成胶囊固定菌，2种胶囊固定菌的除锰率显著高于其对应的游离菌，体现了微生物固定化技术的高效性^〔23〕。胶囊固定菌的除锰率显著大于空白胶囊和游离菌相应的值，主要原因可能有：（1）活性炭与锰氧化菌具有协同作用，活性炭的吸附作用加上锰氧化菌的生物氧化作用使胶囊固定菌的除锰率大大提高；（2）活性炭具有保护作用，活性炭表面存在许多微孔，表面积巨大，可达1 000^{m²/g以上^〔24〕，活性炭发达的孔隙使微生物可以大量附着，并为微生物生长提供了相对稳定的环境；（3）胶囊固定菌有更好的底物耐受性，由于传质扩散作用，胶囊表面到内部、细胞外到细胞内形成由高到低的Mn²⁺浓度梯度，因此胶囊固定菌比游离菌耐受更高的Mn²⁺浓度，除锰率也更高。}

废水COD可能是影响细菌除锰率的一个因素，高COD有利于水体中细菌的生长^〔25〕，但对比实验和正交实验中废水的COD仅为50 mg/L，有机物含量少不利于细菌的生长，而含Mn²⁺培养基中加入了足量的有机物，所以游离菌S1、S2在废水中的除锰率明显小于在含Mn²⁺培养基中除锰率。正交实验结果显示，废水中的Mn²⁺浓度是胶囊固定菌S1除锰过程中非常重要的影响因子，固定菌S1在Mn²⁺质量浓度为50 mg/L时的除锰率是在其余2个浓度下的2倍以上，说明胶囊固定菌S1适用于处理低Mn²⁺浓度的废水；Mn²⁺浓度对胶囊固定菌S2的影响较小，固定菌S2在Mn²⁺质量浓度为250 mg/L时有最大除锰率96.37%，但其在Mn²⁺质量浓度为50、500 mg/L时的除锰率也能达到91.79%和85.93%，胶囊固定菌S2在高浓度和低浓度Mn²⁺废水处理中均适用。胶囊固定菌S1、S2在特定条件下均具备高效除锰能力，胶囊固定菌S2的应用范围较S1更广，后续可进一步验证废水COD对胶囊固定菌除锰率的影响，探讨其应用潜力。

4 结论

（1）从桂林市大新锰矿区周边的土壤中筛选出的2株锰氧化细菌可能为S1巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和S2嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），2株细菌产生的锰转化物都为MnCO₃。

（2）Mn²⁺去除率对比实验表明胶囊固定菌的除锰率显著高于对应游离菌的除锰率。通过正交实验得出胶囊固定菌S1的最佳除锰条件为时间2 d、pH=8.0、Mn²⁺质量浓度50 mg/L、m（活性炭）∶m（海藻酸钠溶液）=0.75∶100，固定菌S2最佳除锰条件为时间2 d、pH=7.0、Mn²⁺质量浓度250 mg/L、m（活性炭）∶m（海藻酸钠溶液）=0.75∶100。

（3）在最佳除锰条件下，胶囊固定菌S1、S2第1次使用时的除锰率分别为95.40%、95.73%，经3轮重复实验后胶囊固定菌的除锰率仍有59.73%、34.60%，说明胶囊固定菌具有一定重复利用性。

参考文献

原文顺序

文献年度倒序

文中引用次数倒序

被引期刊影响因子

[1]

刘学鹏，潘高峰，赵遥菲，等.

地下水中锰污染现状及治理技术进展

［J］. 当代化工研究，2021（23）：89-91. doi:10.3969/j.issn.1672-8114.2021.23.030