工业水处理, 2023, 43(4): 28-35 doi: 10.19965/j.cnki.iwt.2022-0159

专论与综述

微生物固定化技术及其强化生物脱氮研究进展

慕浩,1, 胡凯耀1, 朱红娟1, 彭钰卓1, 王倩1, 王亚娥1, 李杰1,2

1.兰州交通大学环境与市政工程学院, 甘肃 兰州 730070

2.甘肃省膜科学技术研究院有限公司, 甘肃 兰州 730020

Research progress on microbial immobilization technology and its enhanced biological nitrogen removal

MU Hao,1, HU Kaiyao1, ZHU Hongjuan1, PENG Yuzhuo1, WANG Qian1, WANG Yae1, LI Jie1,2

1.School of Environmental and Municipal Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, China

2.Gansu Membrane Science and Technology Research Institute Co. , Ltd. , Lanzhou 730020, China

收稿日期: 2023-02-19  

基金资助: 国家自然科学基金项目.  51768032

Received: 2023-02-19  

作者简介 About authors

慕浩(1997—),硕士E-mail:1418432734@qq.com , E-mail:1418432734@qq.com

摘要

许多研究致力于用生物脱氮技术去除污染水体中的氮。微生物固定化是采用物理或化学的方法,将微生物截留在某一特定区域的技术。该技术既可保证功能微生物在适宜条件下快速增殖,使其具有较高的抵御外界不利环境因素的优势,同时可提高功能微生物与本土微生物的竞争力。生物脱氮技术与微生物固定化技术相结合具有很大的应用潜力。综述了几种传统微生物固定化方法和新型微生物固定化方法的分类、原理、优缺点、应用范围及前景。在此基础上,以凝胶包埋法为例,介绍了微生物固定化技术强化生物脱氮的机理,如为微生物提供相应保护,加快微生物生长富集速度,在凝胶球内外形成不同浓度的溶解氧,以及额外提供功能微生物和营养物质等。以凝胶包埋法加快厌氧氨氧化菌生长富集速度,利用凝胶球内外溶解氧浓度差实现短程硝化-厌氧氨氧化为实例进行阐述。最后对微生物固定化技术强化生物脱氮目前存在的问题进行总结并提出展望,开发成本低廉且稳定性强的固定化材料具有重要意义。

关键词: 固定化 ; 微生物 ; 生物脱氮 ; 凝胶包埋法

Abstract

Many studies have been devoted to remove nitrogen from polluted water bodies by biological nitrogen removal techniques. Immobilization is a technique that uses a physical or chemical method to trap microorganisms in a specific area. The technique ensures rapid proliferation of microorganisms under suitable conditions, giving them the advantage against external adverse environmental factors, while improving the competitiveness of functional microorganisms with local microorganisms. The combination of biological nitrogen removal technology and microbial immobilization technology has great potential for application. The classification, principles, advantages and disadvantages, application and prospects of several traditional and new microbial immobilization methods were reviewed. On the basis, the mechanism of enhanced biological nitrogen removal by by gel embedding method in microbial immobilization technology were introduced, such as providing protection for microorganisms, accelerating the growth and enrichment rate of microorganisms, forming different concentrations of dissolved oxygen inside and outside the bulb, and providing additional functional microorganisms and nutrients. The gel embedding method was used as an example to illustrate the accelerated growth and enrichment of Anammox bacteria, and partial nitrification-anammox by using the difference in dissolved oxygen between the inside and outside of the bulb. Finally, the current problems of microbial immobilization technology to enhance biological nitrogen removal were summarized and the prospect was proposed. It is important to develop low-cost and stable immobilization materials.

Keywords: immobilization ; microorganism ; biological nitrogen removal ; gel embedding

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本文引用格式

慕浩, 胡凯耀, 朱红娟, 彭钰卓, 王倩, 王亚娥, 李杰. 微生物固定化技术及其强化生物脱氮研究进展. 工业水处理[J], 2023, 43(4): 28-35 doi:10.19965/j.cnki.iwt.2022-0159

MU Hao. Research progress on microbial immobilization technology and its enhanced biological nitrogen removal. Industrial Water Treatment[J], 2023, 43(4): 28-35 doi:10.19965/j.cnki.iwt.2022-0159

过量的氮排放会导致水体富营养化,使水生生态系统恶化,进而危害人类健康1。脱氮技术主要分为物化法和生物法。其中物化法包括吹脱法、MAP法、离子交换法等,常用于高氨氮废水的预处理2。除一些特殊废水外,实际中常采用传统硝化—反硝化生物脱氮法对废水进行处理。近年来,传统脱氮理论的认知不断被打破,许多新型生物脱氮技术不断涌现,如短程硝化/厌氧氨氧化、短程反硝化/厌氧氨氧化、同步硝化反硝化等3-5。然而,生物法具有抗冲击负荷能力差、功能菌株易流失、菌体生长缓慢、硝化菌群同反硝化菌群不易共存等缺点6

微生物固定化是通过物理或化学手段,将微生物保留在特定区域内的技术。该技术始于1959年T. HATTORI等7利用树脂对大肠杆菌进行吸附固定化的研究。微生物固定化技术具有以下优点:(1)微生物被固定后不易流失;(2)可提高微生物对恶劣环境的耐受性;(3)可加快微生物生长速度;(4)便于微生物回收再利用。微生物固定化技术因能有效解决生物脱氮中的种种问题,目前广泛应用于环境污染治理行业中8-9

笔者综合近年来国内外研究者对微生物固定化技术在生物脱氮中的研究,介绍了传统和新型微生物固定化的方法及其优缺点,并对凝胶包埋法强化生物脱氮的机理和实例方面进行论述,最后对微生物固定化强化生物脱氮的未来发展方向进行展望。

1 传统微生物固定化方法

传统的微生物固定化方法主要分为物理法和化学法两类,其分类及示意见图1

图1

图1   传统固定化方法分类及示意

Fig. 1   Classification and illustration of traditional immobilization methods


1.1 化学法

化学法根据有无固定化载体分为共价结合法和交联法。共价结合法是将载体表面基团进行活化或在载体表面共价连接双功能试剂后,与微生物表面活性基团直接或通过双功能试剂共价偶联的方法10。交联法是在无载体的情况下,通过双功能试剂使微生物相互形成共价键的方法。常用的双功能试剂有戊二醛等11

经化学法固定后,微生物与载体间由化学共价键相连,结合力强,一般不易从载体上脱附。然而,化学法涉及微生物细胞表面的化学修饰,对微生物有毒害作用,会导致微生物活性降低甚至死亡。在生物脱氮领域,采用化学法固定脱氮微生物的报道较少,一般与吸附法联用。

1.2 吸附法

与结合力强的共价键不同,吸附法的结合力主要为范德华力、氢键、离子键等弱相互作用12。根据不同的结合力,吸附可分为物理吸附和离子吸附。常用的物理吸附材料有活性炭、聚氨酯泡沫、蒙脱土、分子筛等,常用的离子吸附材料有离子交换树脂、离子交换纤维等。

吸附法具有价格低廉、操作便利、对微生物活性影响较小等优点,被广泛应用于生物脱氮领域。Qiang AN等13用花生壳生物炭固定假单胞菌L1去除电镀废水中的Ni(Ⅱ)、Cr(Ⅵ)、Cu(Ⅱ)和硝酸盐,同游离态相比,固定后的假单胞菌L1有更好的污染物去除能力和环境适应能力。然而,由于吸附法结合力较弱,仅用吸附法固定的微生物容易从载体上脱附。因此吸附法常与化学法及包埋法结合使用,在化学试剂或材料中添加吸附材料,可更好地提高微生物固定化效果。Y. ZVULUNOV等14用蒙脱土和聚乙烯亚胺组成的复合材料固定化可降解甲醛的恶臭假单胞菌,其在连续运行多个周期后,对甲醛仍有稳定的降解率。

1.3 包埋法

包埋法所用材料主要有天然高分子材料和合成高分子材料,而纳米材料、磁性材料、无机多孔材料等常作为添加剂以增强材料的性能。无机多孔材料可以显著提高载体的传质性能;纳米材料可以提高载体的比表面积和负载率,并形成适合不同菌群生长的微环境;磁性材料有助于促进微生物生长代谢,且载体便于分离15

根据形成机理的不同,包埋法可分为微胶囊法和凝胶包埋法。微胶囊法是以天然或人工合成的有机高分子材料为囊壁,通过物理化学等手段将微生物包裹在半透性囊膜中的技术,大多数微胶囊直径在1~1 000 μm16。该技术可以显著增强微生物对恶劣环境的抵抗能力。M. MOLLAEI等17将假单胞菌固定在海藻酸盐-壳聚糖-海藻酸盐微胶囊中,显著提高了菌株对苯酚的降解效率。然而,目前微胶囊法在生物脱氮领域中的应用较少。

凝胶包埋法是将微生物拦截固定在具有三维网络结构的水不溶性凝胶中的技术,大多数凝胶球直径在3~5 mm18。凝胶球内复杂多孔的网络结构可以在不泄露微生物的前提下,同时具有良好的传质效率,便于微生物维持良好的活性,是目前微生物固定化最成熟、应用最广泛的方法。凝胶法最常用的材料为PVA(聚乙烯醇)-SA(海藻酸钠)复合材料,聚乙烯醇机械强度高但传质效率低,海藻酸钠机械强度低但传质效率高,两种材料复合可以取长补短。微生物固定化在脱氮中的一些应用案例见表1

表1   微生物固定化在脱氮中的应用案例

Table 1  Application case of microbial immobilization in denitrification

材料固定化方法菌株名称目标污染物去除率/%文献
PVA-SA凝胶法硝化细菌混合体高浓度氨态氮4619
PVA-SA凝胶法硝化细菌混合体不同浓度氨态氮48.3~10020
SA-硅藻土凝胶法不动杆菌SL-14、BC-15、MI-11氨态氮95.8621
菌丝球吸附法假单胞菌GF3硝态氮95.9122
海绵-核桃壳炭-磁铁矿粉吸附法菌胶团L2硝态氮、邻苯二甲酸二乙酯83.97、67.8723
SA-磁铁矿粉凝胶法贪铜菌CC1硝态氮、二价镉100、95.0924
菌丝球-磁铁矿粉吸附法假单胞菌GF2硝态氮98.1425
PVA-SA凝胶法亚硝化单胞菌GH22氨态氮90.326
生物炭吸附法门多萨假单胞菌GL6硝态氮95.827
聚乙烯悬浮球吸附法假单胞菌Y39-6低温低碳氮比下硝态氮24.8328

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2 新型微生物固定化方法

2.1 层层自组装法

层层自组装是利用逐层交替沉积,以静电引力、氢键、共价键等作用力为驱动力,将某种材料交替附着在特定模板上形成一层层薄膜的技术。模板包括但不局限于细胞、酶、高分子有机物、聚电解质等。层与层之间会形成结构完整、性能稳定、具有特定功能的分子聚集体。目前该技术被广泛应用于化学、食品等行业中29-30

实现层层自组装主要有浸泡、旋涂、喷雾3种手段,其原理见图231。该技术可以精准地控制材料薄膜的结构和化学性质,同时材料的特定功能会通过该技术赋予模板。其局限性在于制作周期长,且主要靠静电力、氢键等弱相互作用相结合,稳定性较差,薄膜结构受冲击容易被破坏。

图2

图2   层层自组装技术原理

Fig. 2   The principle of layer-by-layer self-assembly technology


目前,层层自组装技术在众多领域有着较广泛的应用,但主要用于酶或单个细胞的固定化。李辉等32将漆酶固定化,在云母片上制备了阳离子聚丙烯酰胺-漆酶自组装膜,固定化漆酶有良好的热稳定性和可重复使用性。Peng WANG等33以溶菌酶和SA为原料,采用该技术在纳米纤维表面交替沉积醋酸纤维素膜固定化溶菌酶,固定化后的酶对恶劣环境有较好的耐受性。

微生物对聚电解质、纳米粒子非常敏感,组装过程可能会对微生物活性产生不利影响。同时,由于该技术形成的薄膜通常为纳米级,远小于细胞直径,导致薄膜不能完全将细胞包裹起来,因此,对于含有大量脱氮微生物的活性污泥絮体,采用该技术固定化的难度会大大增加。虽然该技术在生物脱氮领域中处于起步阶段,然而,其可将材料的特定功能赋予微生物,针对不同的外界环境因素为微生物提供相应的“保护壳”,具有很好的应用前景。

2.2 静电纺丝法

静电纺丝是在高压静电场下,将聚合物溶液或熔体加工成纳米纤维的技术。其原理为聚合物溶液通过注射泵施压,在喷头处形成液滴,喷头与收集器之间的高压静电会使液滴变为泰勒锥,当电压足够大时,聚合物溶液就会形成射流,经一段时间运动后落在收集器上形成纳米纤维34。静电纺丝技术固定化酵母菌的流程见图335

图3

图3   静电纺丝固定化酵母菌流程

Fig. 3   Process of immobilizing yeast by electrostatic spinning


静电纺丝技术制成的纤维具有比表面积大、孔隙率高、纤维结构可控、成本低等优点,广泛应用于生物医学、食品、环境工程等行业中。该技术可将微生物固定在纳米纤维中,加快微生物生长繁殖的速度,增强对恶劣环境的耐受性。T. JAYANI等36通过静电纺丝将名为嗜酸乳杆菌016的益生菌固定在纳米纤维上,力学性质和热分析结果表明该纳米纤维可用于食品中传递益生菌;同时,扫描电镜表明,24 d内固定在纳米纤维上的益生菌没有受到损伤。O. F. SARIOGLU等37利用由聚己内酯和聚乳酸制成的纳米纤维固定可降解纺织染料的微生物,结果发现,被固定的微生物具有更高的污染物降解能力和更强的环境耐受性。Yansheng FAN等38将酵母菌固定在聚丙烯酰胺纳米纤维上,制备了一种含活酵母菌的纤维材料,可用于生物发酵、废水处理、基因工程等领域。虽然静电纺丝技术在众多行业中有广泛应用,但用于生物脱氮的相关报道很少。随着该技术的发展,生物脱氮领域中采用该技术固定微生物具有很大的应用潜力。

虽然新型微生物固定化方法具有众多优势,但在生物脱氮领域中仍需要很长的发展时间。目前,凝胶包埋法依然是生物脱氮领域中应用最广泛且成熟的固定化方法。几种微生物固定化方法的原理及优缺点见表2

表2   几种微生物固定化方法的原理及优缺点

Table 2  Principles and advantages and disadvantages of several methods for immobilization of microorganisms

固定化方法原理优点缺点成本
化学法微生物之间或微生物与载体间通过化学键相连结合力强,微生物高度密集且不易从载体上脱附化学试剂对微生物有毒害作用,导致微生物活性降低
吸附法微生物与载体间通过范德华力、离子键等弱相互作用相连操作简单,对微生物无毒害作用,载体可以再生结合力较弱,微生物易从载体上脱附
包埋法微生物被截留在水不溶性的凝胶聚合物中操作简单,可固定化特定微生物,适用性广泛传质阻力较大,长期运行后微生物易从凝胶聚合物中泄漏
层层自组装法通过静电作用力将特定材料一层层交替沉积在微生物上组装过程可控,条件温和,可将材料的特性赋予微生物稳定性差,制作周期较长,在生物脱氮中应用较少
静电纺丝法微生物与聚合物溶液的混合液在高压静电场下形成纳米纤维操作简单,制成的纳米纤维比表面积大、孔隙率高纳米纤维强度较低,产量低,在生物脱氮中应用较少

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3 凝胶包埋法强化生物脱氮的机理

3.1 为微生物提供保护

凝胶球可为微生物提供相应的保护,为微生物提供适应环境的时间,同时降低外界不利环境因素对微生物的负面作用,使脱氮微生物能够更好地生长繁殖,提高脱氮效率。Xuan YU等38用SA-高岭土制作了凝胶球固定假单胞菌LZ-4,在游离菌株体系中,Cr(Ⅵ)的存在使硝酸盐去除率降低86.07%,而固定化菌株则保护了体系的反硝化作用,并去除95%的硝酸盐。与此同时,凝胶球也可减轻低温对微生物活性的影响,降低高盐度对微生物的毒害作用28

3.2 加快微生物富集

采用凝胶包埋法可以有效提高微生物的生长富集速度。这是因为凝胶球易沉降,被固定的微生物不易流失,同时凝胶球的微孔结构可以给其提供有利的生长繁殖条件39。微生物释放的胞外聚合物(EPS)主要包含蛋白质和多糖,蛋白质的疏水作用可使微生物形成聚集体40。被固定在凝胶球中的微生物更容易释放EPS,使微生物更加牢固且密集地同凝胶球内的网状结构结合41。同时,将微生物固定在凝胶球中不会改变现有微生物群落,但对优势菌群的富集有积极的影响42

3.3 内外溶解氧浓度不同

由于凝胶球结构紧密且氧传质具有阻力,造成凝胶球外部呈好氧态而内部呈缺氧态。凝胶球外部的好氧环境和内部的缺氧环境可为传统的硝化/反硝化菌提供适宜的生长条件,有利于同步硝化反硝化(SND)作用的发生。

好氧反硝化菌是一类在有氧条件下进行反硝化作用的异养菌,该类菌大多还具备异养硝化的功能,好氧反硝化菌可以从微生物角度实现SND43。好氧反硝化菌中的亚硝酸盐还原酶(NiRs)可将NO2--N还原为NO,然而NiRs在好氧条件下会被抑制,导致NO2--N积累。该过程是好氧反硝化中的限速步骤,通过微生物固定化技术可以有效减少NO2--N的积累量,提高TN去除效率。Fang MA等44采用SA凝胶球固定假单胞菌T13,凝胶球内部缺氧的条件使其表现出较高的NiRs活性,固定化菌株对TN的去除率最高可达57.25%,而游离菌株对TN的去除率仅为29.7%。陈均利等45用PVA-SA-活性炭固定菌株WT14,结果表明,固定化技术显著减少了NO2--N积累量,与游离菌(30.2%)相比,固定化菌株对TN的去除率更高(55.5%)。

3.4 额外提供功能微生物和营养物质

利用凝胶包埋法可将生物脱氮系统缺少的功能微生物固定化后投加至原本系统中以强化脱氮作用。人工湿地是20世纪70年代末发展起来的一种污水处理新技术,因具有成本低、高效节能、景观性好等优势,广泛用于处理各类废水46。人工湿地中的氮素通过植物根部吸收、填料基质吸附、氨挥发、微生物作用等方式被去除。Shunan ZHANG等47发现微生物主导的硝化/反硝化反应是人工湿地脱氮的主要途径,占总脱氮量的66.9%~80.5%。然而,水力冲刷和原生动物捕食等原因会导致人工湿地的碳源不足、生物质浓度低,极大地限制人工湿地的脱氮效率。为解决这两大问题,可向人工湿地中投加额外碳源和硝化/反硝化菌。然而在外界因素干扰下,直接投加的游离菌体的生长速率和脱氮效率低,菌体易流失。将微生物固定化后投入可大幅提高人工湿地的脱氮效率。Wei WANG等48在对硝化细菌进行固定化的同时,外加小分子有机碳源对人工湿地进行强化脱氮。然而,直接向人工湿地中投加小分子有机碳源的量不确定,投加量不足会导致反硝化反应不完全,投加量过高则会引发二次污染。Guanlong YU等49用处理后的稻壳当作固体缓释碳源,用PVA、SA将稻壳和反硝化菌共固定化形成凝胶球,投加至水平潜流式人工湿地。投加凝胶球强化后的人工湿地平均TN去除率可达78.4%,而未投加凝胶球的对照组的TN去除率仅有23.69%。碳源的持续释放和反硝化菌丰度的增加是TN去除率增加的主要原因。与此同时,还可通过固定一些耐盐、耐低温的特殊微生物来提高人工湿地在高盐度、低温下的脱氮效率50

4 凝胶包埋法强化生物脱氮实例及局限性

4.1 在厌氧氨氧化系统中的应用

厌氧氨氧化过程无需添加有机碳源及曝气,污泥产量少且能耗较低,具有广阔的应用前景51。但由于厌氧氨氧化菌生长速率低且菌体易流失,反应器启动缓慢,研究多停留在实验室阶段,大规模实际应用较少。

厌氧氨氧化反应器的启动时间一般长达数月或更久,凝胶包埋厌氧氨氧化菌可大幅缩短启动时间52。K. ISAKA等53用聚乙二醇凝胶包埋厌氧氨氧化污泥,在25 d内成功启动了厌氧氨氧化反应器。此外,凝胶包埋法不仅可以缩短厌氧氨氧化的启动时间,还可减少启动所需生物量,加快脱氮速率。M. ALI等54利用PVA-SA凝胶球固定厌氧氨氧化菌,研究表明,固定化反应器中初始生物量质量浓度为0.33 g/L(以VSS计,下同),运行35 d后脱氮速率可达10.8 kg/(m3·d)(以N计,下同),而非固定化反应器中初始生物量质量浓度为2.5 g/L,35 d后脱氮速率仅为3.5 kg/(m3·d)。

然而,获得足够数量的厌氧氨氧化生物量直接启动大规模反应器较困难。有报道称,将活性污泥包埋在PVA-SA凝胶中可用于启动厌氧氨氧化,这为大规模启动厌氧氨氧化反应器提供了可能55。K. CHO等55采用预先培养的厌氧氨氧化菌(R1)和包埋在PVA-SA凝胶中的活性污泥(R2)成功启动厌氧氨氧化反应器,运行稳定后R1的平均脱氮率为0.35 kg/(m3·d),R2的平均脱氮率为0.36 kg/(m3·d)。高通量测序表明:启动开始阶段,两个反应器中的细菌群落结构完全不同;但在启动完成阶段,两个反应器中的厌氧氨氧化菌数量相当。

近年来,短程硝化和厌氧氨氧化相结合的工艺成为研究热点。短程硝化可将部分NH4+-N转化为NO2--N并形成积累,与另一部分未转化的NH4+-N发生厌氧氨氧化反应。实现短程硝化需要严格控制反应器的溶解氧,使氨氧化菌(AOB)发挥作用的同时,抑制亚硝酸盐氧化菌(NOB)的作用。由于凝胶球具有氧传质阻力,凝胶包埋法被广泛用于短程硝化/厌氧氨氧化。Jinxing WANG等56采用PVA凝胶珠固定厌氧氨氧化颗粒污泥和普通活性污泥混合物,实现了短程硝化/厌氧氨氧化处理低浓度NH4+-N废水。进水中部分NH4+-N被凝胶球外层的AOB氧化为NO2--N,剩余NH4+-N和生成的NO2--N被球内部的厌氧氨氧化菌(AAOB)转化为N2。由于外层AOB消耗氧,保护了内层AAOB不受氧的抑制,同时其特殊结构成功抑制了NOB56

4.2 存在问题

虽然凝胶包埋法强化生物脱氮技术在实验室规模的研究中表现出良好的应用前景,但目前仍很难大规模实际应用。在水质方面,实际废水的水质波动大、组成成分复杂、运行操作复杂,限制了凝胶包埋技术在生物脱氮过程中的全面应用。在经济方面,实际应用中需根据污水厂的规模制备大量凝胶球,显著增加了污水厂的运行成本。在使用寿命方面,外界水力冲刷和凝胶球内部微生物的大量繁殖会导致凝胶球稳定性降低甚至破碎。因此开发成本低且稳定性强的包埋材料具有重要意义。

5 总结与展望

微生物固定化技术在生物脱氮中具有广泛应用,每种技术都有相应的优缺点。目前凝胶包埋法依然是应用最广泛的微生物固定化技术。凝胶包埋法固定微生物的过程不仅会减少外部不利环境因素对微生物的负面影响,还会促进微生物的生长,提高微生物菌体密度。特别地,由于氧传质具有阻力,凝胶球由外到内会形成氧浓度梯度,便于特定菌株生长。虽然微生物固定化技术同生物脱氮相结合已较为成熟,但还需在以下方面进行研究:

(1)分析凝胶球中功能微生物的代谢机制,探索如何使微生物更快速地生长、富集,为实际应用提供理论依据。

(2)研究凝胶球中微生物群落的结构演替,阐明脱氮微生物与其他微生物相互作用的机制,为维持凝胶球中微生物平衡提供指导。

(3) 研究微生物同固定化材料的作用机制,开发新型固定化材料。

(4)进一步研究层层自组装、静电纺丝等新型固定化技术,更好地提高固定化微生物的稳定性、生物相容性,及对不利环境的耐受性。

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