工业水处理, 2019, 39(7): 89-93 doi: 10.11894/iwt.2018-0506

• 分析与监测 •

制药工业废水中14种沙星类抗生素的液相色谱分析法

王雪平,, 朱惠斌,

Liquid chromatographic analysis of 14 kinds of afloxacin antibiotics in pharmaceutical industrial wastewater

Wang Xueping,, Zhu Huibin,

通讯作者: 朱惠斌,副教授。E-mail:kfzhuhuibin@163.com

收稿日期: 2019-04-1  

基金资助: 河南省科技厅支持项目.  172102410035
黄河水利职业技术学院2018年科技项目.  2018XJJGLX023

Received: 2019-04-1  

Fund supported: 河南省科技厅支持项目.  172102410035
黄河水利职业技术学院2018年科技项目.  2018XJJGLX023

作者简介 About authors

王雪平(1978-),硕士,副教授E-mail:hhxxttxs2016@qq.com , E-mail：hhxxttxs2016@qq.com

摘要

采用Na2EDTA螯合制药工业废水中的金属离子，通过HLB固相萃取柱的富集、净化，经C18色谱柱分离，荧光检测器测定，建立了高效液相色谱法同时测定制药工业废水中14种沙星类抗生素残留量的方法。结果表明：在0.5~100.0 mg/L范围内，14种沙星类抗生素浓度与其色谱峰峰面积具有良好的线性关系，相关系数均≥ 0.999；方法检出限为0.005~0.070 mg/L，测定下限为0.02~0.28 mg/L；加标平均回收率为90.7%~98.1%，RSD为1.1%~3.2%。

关键词： 沙星类抗生素 ; 制药工业废水 ; 高效液相色谱

Abstract

The metal ions in the pharmaceutical industrial wastewater were chelated by Na2EDTA, and then the high performance liquid chromatography method for simultaneous determination of 14 kinds of afloxacin antibiotics residues in pharmaceutical industrial wastewater was established through enrichment and purification by HLB solidphase extraction column, separation by C18 column, determination by fluorescence detector. The results showed that there was a good linear relationship between the mass concentration of 14 antibiotics and their chromatographic peak areas in the range of 0.5 mg/L to 100.0 mg/L, and correlation coefficient were ≥ 0.999. The detection limit of the method ranged from 0.005 mg/L to 0.070 mg/L, and the lower limit of determination ranged from 0.02 mg/L to 0.28 mg/L. The average recoveries ranged from 90.7% to 98.1%, and the relative standard deviations ranged from 1.1% to 3.2%.

Keywords： afloxacin antibiotics ; pharmaceutical industrial wastewater ; high performance liquid chromatography

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王雪平, 朱惠斌. 制药工业废水中14种沙星类抗生素的液相色谱分析法. 工业水处理[J], 2019, 39(7): 89-93 doi:10.11894/iwt.2018-0506

Wang Xueping. Liquid chromatographic analysis of 14 kinds of afloxacin antibiotics in pharmaceutical industrial wastewater. Industrial Water Treatment[J], 2019, 39(7): 89-93 doi:10.11894/iwt.2018-0506

沙星类抗生素也称为喹诺酮类抗生素，因具有强大的广谱杀菌作用在临床上被广泛应用〔1-4〕。但抗生素制药工业也产生了很多污染物，尤其是化学制药工业废水，据统计其污水排放量占全国污水排放量的2%〔5-6〕，而现有废水处理工艺无法将化学制药工业废水中存在的沙星类抗生素残留完全去除。沙星类抗生素随着废水排放进入生态环境后，可诱导病原菌产生抗药性，可在农副产品中残留，可通过食物链对人类健康构成潜在威胁〔7-8〕。因此，需加强对制药工业废水中抗生素残留种类及其残留量的监督检测。

目前关于沙星类抗生素的检测方法主要有毛细管电泳法〔9〕、免疫法〔10〕、液相色谱法（HPLC）〔11-15〕、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）〔16-19〕等，其中LC-MS/MS法因检测灵敏度好、低检出限而被广泛应用于医药、食品、化工、环境等领域，但由于LC-MS/MS仪器昂贵、分析成本高，且操作复杂，不适合中小企业和基层环保部门对制药工业废水中沙星类抗生素的日常检测需求。笔者采用螯合剂和萃取柱对制药工业废水进行前处理，结合高效液相色谱法测定制药工业废水中14种沙星类抗生素，研究了螯合剂种类、萃取柱种类、流动相条件等因素对萃取效率的影响，并应用于制药工业废水中14种沙星类抗生素残留量的检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪，配有荧光检测器FLD，美国Agilent公司；AC210S型电子天平，德国萨多利斯公司；Vortex-Genie2涡旋混合仪，美国Scientific Industries公司；5430R型高速离心机，德国艾本得公司；Milli-Q超纯水器，美国Millipore公司；Autotrace SPE全自动固相萃取仪，美国Caliper公司；pHSJ.5型pH计，上海仪电科学仪器有限公司；MG-2200型氮吹仪，日本EYELA公司。

14种沙星类抗生素标准品：诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、丹诺沙星、培氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、司帕沙星、二氟沙星、加替沙星、奥比沙星，美国Dr. Ehrenstorfer GH公司，纯度均≥95.0%。甲醇、甲酸、乙腈、三乙胺，均为色谱纯，德国Merk公司；Na2EDTA、盐酸、磷酸均为分析纯；试验用水为超纯水。

14种沙星类抗生素标准混合溶液：分别准确称取适量的16种沙星类抗生素标准品，用适量体积比85:15的甲醇和乙腈混合溶液溶解并定容，配制成0.1 g/mL的标准混合溶液。

1.2 液相色谱条件

色谱柱：Hydrosphere C18（250 mm×4.6 mm×5 μm）；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；荧光检测器检测波长（激发波长280 nm，发射波长450 nm）；流动相A是体积比为85:15的甲醇和乙腈混合溶液，流动相B是0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（用1.0 mol/L三乙胺调节pH=3.5），梯度洗脱，即10%A洗20 min，然后10%~35%A洗15 min，50%A洗10 min，最后10% A洗10 min。

1.3 样品前处理

以0.45 μm微孔滤膜过滤除去制药工业废水中的悬浮物后，准确量取制药工业废水100 mL，加入1 g金属沉淀剂Na2EDTA，摇匀后静置5 min，8 000 r/min离心5 min，用1 mol/L盐酸溶液调节上清液pH至4.0，通过HLB固相萃取柱富集、净化。上清液过HLB柱前，HLB柱依次用3 mL丙酮、3 mL甲醇和3 mL水活化；过HLB柱时，流速控制在1 mL/min以内；过HLB柱后，用6 mL水淋洗，负压抽干，用6 mL含体积分数0.1%甲酸的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，45 ℃水浴中氮吹至近干，用流动相B溶解并定容至1 mL，用0.22 μm有机滤膜过滤，滤液供HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

利用荧光检测器（FLD）对沙星类抗生素在200~800 nm范围内进行多激发和多发射扫描试验，以确定最佳的激发波长和发射波长，结果见表1。

表1   沙星类抗生素化合物信息

序号化合物保留时间/min激发波长/nm发射波长/nm
1依诺沙星（ENO）12.36280451
2氧氟沙星（OFL）14.32282458
3培氟沙星（PEF）18.34279448
4诺氟沙星（NOR）20.21280450
5环丙沙星（CIP）22.45281455
6洛美沙星（LOM）24.23280450
7丹诺沙星（DAN）30.37280450
8恩诺沙星（ENR）34.28261430
9奥比沙星（ORB）41.76266392
10沙拉沙星（SAR）42.48298500
11二氟沙星（DFX）45.12294549
12司帕沙星（SPA）48.27355620
13加替沙星（GTF）51.23355520
14达氟沙星（DNF）52.75280450

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如表1所示，14种沙星类抗生素均具有荧光响应，最大激发波长为261~355 nm，最大发射波长为390~620 nm。大部分沙星类的激发波长和发射波长最大吸收波长较为接近，为便于检测分析，综合考虑选择280 nm和450 nm作为荧光检测的激发波长和发射波长。

2.2 色谱柱的选择

分别比较了Hydrosphere C18、Penomenex C18、Diamonsil C18、XTerra C18、Inertsil C18等不同型号C18柱对14种沙星类抗生素的色谱分离情况，结果表明，Hydrosphere C18（250 mm×4.6 mm×5 μm）色谱柱可实现对14种沙星类抗生素的分离，且各分析物的色谱峰响应值较高，峰形较好，故选择Hydrosphere C18作为分离色谱柱。其色谱分离情况见图1。

图1

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图1   沙星类抗生素标准品高效液相色谱图


2.3 流动相的选择

分别比较了甲醇/乙腈-水、甲醇/乙腈-磷酸盐缓冲液、甲醇/乙腈-乙酸铵溶液等流动相体系对14种沙星类抗生素的色谱分离情况。结果表明：甲醇/乙腈-水或甲酸溶液作为流动相时，响应值不高、不能实现基线分离；甲醇/乙腈-乙酸铵溶液作为流动相时，色谱峰拖尾严重；甲醇/乙腈-磷酸缓冲液作为流动相时，响应值较高，可实现基线分离，诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、加替沙星的色谱峰拖尾，但加入三乙胺后色谱峰拖尾现象消除；当使用体积比85:15的甲醇/乙腈-0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（用三乙胺调节pH=3.5）作为流动相时，14种沙星类抗生素经梯度洗脱后可有效分离，无拖尾峰，峰形尖锐且对称，其色谱图见图1。

2.4 固相萃取柱的选择

鉴于大多数沙星类抗生素是酸碱两性化合物，且具有较强的极性，分别考察了MCX（混合型阳离子）、MAX（混合型阴离子）、HLB（亲水-亲酯）、SIL（硅胶）、AluN（中性氧化铝）、C18（反相）等不同型号固相萃取柱对14种沙星类抗生素的分离情况。结果表明：6种不同填料的固相萃取柱对沙星类抗生素的萃取率不同，按10次重复测量，萃取率在56.8%~95.4%，其中亲水-亲酯固相萃取柱HLB的萃取率较高，其对14种沙星类抗生素平均萃取率为93.6%，相对标准偏差为2.8%，这可能是由于大多数沙星类抗生素是酸碱两性化合物，且具有较强的极性，可与亲水-亲酯固相萃取柱HLB较好地进行吸附和洗脱，从而其萃取率较高。故固相萃取柱选择HLB柱。

2.5 金属螯合剂的选择

由于部分沙星类抗生素（氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星等）可与污水中的Cu2+、Cd2+、Hg2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Cr3+等金属离子形成螯合物从而影响其提取率，故分析了二甲基二硫代氨基甲酸钠（SDD）、乙二胺四乙酸钠（Na2EDTA）、二乙基三胺五乙酸（DTPA）、氨基三亚甲基膦酸（ATMP）等不同金属螯合剂对制药工业污水中沙星类抗生素提取效率的影响。结果表明：（1）在制药工业污水中加入一定量的金属螯合剂后，虽出现絮状沉淀，但有利于提高沙星类抗生素的提取率，尤其是采用Na2EDTA金属螯合剂时，沙星类抗生素提取率最高。（2）随着Na2EDTA加入量逐渐增大，沙星类抗生素提取率呈现递增并逐渐饱和趋势，这可能是由于Na2EDTA与沙星类抗生素都对污水中金属离子发生螯合作用，但Na2EDTA螯合作用较强，通过螯合诱导打破沙星类抗生素与金属离子的平衡，释放出游离的沙星类抗生素，从而提高沙星类抗生素提取率；当Na2EDTA加入质量为1 g时，沙星类抗生素提取率高达98.7%。故选择Na2EDTA金属螯合剂，且加入质量为1 g。

2.6 线性范围、方法检出限和测定下限

将不含目标物的制药工业废水作为溶剂，依次配制质量浓度为0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L的14种沙星类抗生素混合标准工作液，进行HPLC测定，以色谱峰峰面积（y）为纵坐标，以沙星类抗生素的质量浓度（x）为横坐标，绘制标准工作曲线，结果见表2。

表2   线性范围、检出限、回收率和精密度

序号化合物回归方程线性范围/（mg·L-1）相关系数方法检出限/（mg·L-1）测定下限/（mg·L-1）平均回收率/%RSD/%
1NORy=86.66x-0.020.1~100.00.999 80.0250.196.31.8
2CIPy=230.66x-0.360.1~100.00.999 30.0170.06893.72.5
3LOMy=68.53x-0.560.1~100.00.999 20.0120.04892.61.7
4DNFy=338.63x+0.660.1~100.00.999 60.0070.02892.32.3
5ENRy=38.28x+0.060.1~100.00.999 20.0120.04897.42.2
6SARy=302.28x+0.620.5~100.00.999 50.0700.2891.31.9
7DANy=326.26x-0.020.5~100.00.999 40.0290.11698.11.9
8PEFy=362.56x+0.660.5~100.00.999 60.0350.1493.23.2
9ENOy=326.62x-0.060.1~100.00.999 80.0150.0692.82.1
10OFLy=25.62x-0.320.1~100.00.999 20.0230.09292.12.3
11SPAy=26.26x-0.020.5~100.00.999 20.0270.10897.91.9
12DFXy=66.62x-0.060.1~100.00.999 30.0210.08490.71.5
13GTFy=565.63x-0.060.1~100.00.999 90.0050.0292.41.1
14ORBy=60.66x+0.650.5~100.00.999 30.0480.19293.72.3

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依据国家环境保护行业标准《环境监测分析方法标准制修订技术导则》（HJ 168-2010），重复11次空白试验，测定11次平行测定的标准偏差，计算方法检出限（MDL），并以4倍检出限作为测定下限。由表2可知，沙星类抗生素在0.5~100.0 mg/L范围内，线性关系良好，且相关系数≥0.999 2。14种沙星类抗生素的方法检出限为0.005~0.070 mg/L，测定下限为0.02~0.28 mg/L。

2.7 回收率和精密度

取空白基质制药工业废水进行加标回收实验，加标浓度按低中高3个水平分别设为0.5、50.0、100.0 mg/L，按上述所建HPLC法进行测定，每个水平重复测定6次，结果见表2。可知14种沙星类抗生素的平均回收率为90.7%~98.1%，相对标准偏差（RSD）为1.1%~3.2%。

2.8 实际样品的测定

采用本研究所建HPLC法，对30份实际制药工业废水进行14种沙星类抗生素种类和含量快速筛查。

结果表明：30份所检制药工业废水中，6份废水呈阳性检出沙星类抗生素，6份废水均来源于抗生素制药厂废水池，其余24份废水呈阴性，废水来源于合成药物生产废水、中成药生产废水。6份呈阳性废水检出的沙星类抗生素主要为：氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星、洛美沙星等，尤其是氧氟沙星检出率最高，且检出残留量最高达5.28 mg/L，RSD为1.2%，检出氧氟沙星样品的液相色谱图如图2所示。这可能是由于氧氟沙星自上市以来，以其高效、广谱、安全等特点而得到广泛应用，是目前临床上最常用的抗菌药物之一。

图2

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图2   某阳性样品高效液相色谱图


2.9 与现有分析方法的比较

对比本研究的HPLC法与文献报道的分析方法〔18-22〕，结果见表3。

表3   不同分析方法比较

样品仪器沙星类抗生素回收率/%RSD/%检出限
水LC-MS/MS〔18〕5种81.5~1166.0~14.10.3~1.0 ng/L
污水LC-MS/MS〔19〕8种73.8~1132.6~13.20.2~1.0 ng/L
鸡粪HPLC〔20〕6种76.7~106.70.7~14.40.002~0.022 mg/kg
土壤HPLC〔21〕4种60.4~99.32.6~13.20.58~1.0 μg/kg
化妆品HPLC〔22〕19种75.5~105.10.4~1.11.2~14.7 mg/kg
污水HPLC（本研究）14种90.7~98.11.1~3.20.005~0.070 mg/L

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由表3可知，本方法所用HPLC仪器设备普遍易得、操作简便，与文献报道的HPLC法相比，同时测定的沙星类抗生素种类较多，回收率高、精密度好，且加标回收率和相对标准偏差符合《化学实验室内部质量控制比对试验》（RB/T 208-2016）和《检验检测机构资质认定能力评价检验检测机构通用要求》（RB/T 214-2017）的要求。

3 结论

研究建立了制药工业废水中14种沙星类抗生素残留的高效液相色谱法同时分析方法，与其他分析方法相比，该方法具有样品前处理操作简便、回收率高、精密度好，可同时测定多种沙星类抗生素，适用于制药工业废水中同时测定多种沙星类抗生素残留量。

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