有研究表明，环境内分泌干扰物质（EDCs）即广义上的环境雌激素（EEs）可能严重破坏人和动物体内的激素水平，导致内分泌功能紊乱^〔1〕。环境中的雌激素主要包括17β-雌二醇（E2）、雌酮（E1）、雌三醇（E3）等，极易迁移和转化，能以极低的含量对生物造成影响^〔2〕。微生物降解被认为是治理环境和污水处理厂中雌激素污染的主要方法。目前已筛选出很多雌激素降解菌，但在复杂水环境中雌激素降解菌的生长繁殖速度缓慢，对雌激素的去除效果不理想^〔3〕。因此，如何改善污水处理环境、提高雌激素降解菌的生长繁殖速度，是亟待解决的问题。微藻与细菌可以形成共生关系，构成良好的循环系统。微藻为细菌生长提供氧气和营养物质，细菌可为微藻提供二氧化碳和生长因子，且消耗微藻生长过程中积累的胞外多糖等物质^〔4〕，为其自生长提供有利条件^〔5〕。

有些微藻（如栅藻）可以去除雌激素^〔6〕。因此，研究藻菌共生体系对雌激素的去除是解决雌激素污染的一种新思路。目前少有报道研究藻菌去除雌激素时对藻菌生长的影响和对雌激素的去除效果，笔者主要探讨了藻菌共生去除雌激素的特性，为其后续应用提供基础数据。

实验所用栅藻筛选于吉林博大酒业污水处理池。雌激素降解菌为实验室从松花湖水中筛选出的具有降解雌激素作用的嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。

E2是诸多环境雌激素中作用最强的一种，普遍存在于各类环境中，即使在极低质量浓度（1.0 ng/L）下也会对生物体产生明显影响。故实验选择E2作为被降解雌激素。

E2储备液（20 mg/L）：称取5 mg E2溶于95%乙醇。

BG11培养基（pH=7.1）：NaNO₃ 1.5 g/L、Na₂CO₃0.02 g/L、Na₂EDTA 0.001 g/L、CaCl₂·2H₂O 0.036 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.075 g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.04 g/L、柠檬酸0.06 g/L、柠檬酸铁铵0.06 g/L、H₃BO₃ 2.86 g/L、MnCl₂ 1.81 g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.222 g/L、CuSO₄·5H₂O 0.079 g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.39 g/L、Co（NO₃）2·6H₂O 0.049 g/L。

无机盐培养基（pH=7.0）：K₂HPO₄ 3.5 g/L、KH₂PO₄ 1.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO₄ 0.15 g/L、NaHCO₃ 0.002 g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.000 2 g/L、（NH₄）₂Mo₂O₄·4H₂O 0.000 2 g/L、CuSO₄·5H₂O 0.001 g/L、CaCl₂·2H₂O 0.000 5 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.005 g/L。

LB培养基（pH=7.0）：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L。

以上培养基在使用时均在121 ℃灭菌20 min，固体培养基加入15 g琼脂。

将装有800 mL BG11培养基的锥形瓶用4层纱布封口，放入高压蒸汽灭菌锅中，121 ℃灭菌20 min。完成灭菌后，待培养基温度降到不烫手时接种无菌栅藻。接种完毕将培养基放至光照培养箱中培养，光照条件12:12，培养至OD₆₈₅在0.3左右。按每瓶50 mL的量分装到100 mL锥形瓶中，向分装好的锥形瓶中加入20 mg/L经121 ℃灭菌20 min的E2储备液，使E2最终质量浓度分别为0、0.5、1、2、4 mg/L。冷却后，分别加入50 mL吸光度在0.3左右的栅藻培养液^〔7〕。每个浓度3组平行，另设置1个对照组不加入栅藻。将锥形瓶放入28 ℃、150 r/min全温摇床中进行栅藻去除E2实验。培养10 d后，用色谱检测培养液中E2的残留量，计算E2去除率。

向50 mL无机盐培养基中加入20 mg/L E2储备液，使E2质量浓度分别为0.5、1、2、4 mg/L，每个浓度3组平行，对照组不加E2，121 ℃下灭菌20 min。将嗜麦芽窄食单胞菌活化到对数生长期（OD₆₀₀在0.3左右）接种到上述灭完菌的培养基中，将其放入28 ℃、150 r/min全温摇床中培养。培养10 d后，用色谱检测培养液中E2的残留量，计算E2去除率^〔8〕。

向1 000 mL锥形瓶中加入800 mL BG11培养基，用4层纱布封口，随后将培养基放入高压蒸汽灭菌锅中，121 ℃下灭菌20 min。待灭菌后的培养基不烫手时接入无菌栅藻，接种完毕将锥形瓶放入光照培养箱中进行培养。当栅藻培养液的吸光度达到0.3左右时，将其按每瓶50 mL的量分装到100 mL锥形瓶中，并向其中加入20 mg/L经121 ℃灭菌20 min的E2储备液，使E2质量浓度分别为0.5、1、2、4 mg/L。分装完成后，将1 mL嗜麦芽窄食单胞菌接种到培养基上，置于28 ℃、150 r/min全温摇床中培养。将只加入栅藻和嗜麦芽窄食单胞菌、不加入E2的培养基作为对照组。实验组和对照组都设置3个平行样。培养10 d后用色谱检测培养液中的E2残留量，计算E2去除率。

栅藻生物量通过测定栅藻细胞个数来确定。每天定时取1.2.1中的栅藻培养液和1.2.3中的藻菌互作培养液，用血球计数板在显微镜下计数。

嗜麦芽窄食单胞菌的生物量用菌落形成单位（CFU）表示。每天定时取0.5 mL嗜麦芽窄食单胞菌培养液和藻菌互作培养液，用无菌水进行稀释，根据实际情况设置稀释倍数。稀释完毕后，取50 μL稀释液涂布到LB固体培养基上，将平板放入28 ℃恒温培养箱中培养，每个稀释度3组平行，对平板长出的单菌落稀释度进行计数^〔9〕。

培养10 d后，分别取栅藻培养液、嗜麦芽窄食单胞菌培养液和藻菌互作培养液10 mL于离心管中，4 000 r/min下离心10 min，取5 mL上清液移至分液漏斗中，向分液漏斗中加入10 mL乙酸乙酯。震荡后静置，待完全分层后放出水相，取5 mL上层有机相于试管中，水浴蒸干，待乙酸乙酯挥发后加入2.5 mL甲醇，震荡混合后过0.45 μm滤膜，样品在4 ℃下避光保存，于24 h内完成检测。

流动相为乙腈和水，乙腈45%、水55%，流速1 mL/min，检测波长205 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL，E2出峰时间在10.12~10.82 min之间。

配制50 mg/L E2储备液，用甲醇依次稀释至质量浓度为40、30、20、10、1、0.8、0.6、0.4、0.2 mg/L标准液，按色谱条件进行标准曲线的绘制。以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，结果表明E2在0.2~1 mg/L范围内有良好的线性关系，回归方程为y=2E+0.6x-367 157，相关系数R²=0.999。

栅藻单独去除雌激素时，不同质量浓度的E2对栅藻生物量的影响如图1所示。

图1表明，E2在实验质量浓度范围内对栅藻有一定的抑制作用，并随E2的增加而增强。E2为0.5~2 mg/L时栅藻的生长曲线几乎重合，第7天开始，4.0 mg/L E2体系中栅藻受到的抑制与其他浓度体系存在明显差异，且这种抑制作用持续整个实验过程。该抑制作用与何宁^〔10〕的研究结果类似。

雌激素降解菌和栅藻相互作用去除雌激素时，雌激素降解菌对栅藻生长的影响如图2所示。

由图2可见，没有雌激素时，藻菌体系明显对栅藻生长有刺激作用，这种作用在第4天开始变得明显，一直持续到整个实验结束。考虑到采用栅藻单独去除E2时，E2为4 mg/L的体系对栅藻生长抑制十分明显，因此选择4 mg/L的体系分析E2存在下降解菌对栅藻生长的影响。结果表明，藻菌相互作用体系中，尽管E2对栅藻生长仍有抑制作用，但与栅藻单独作用体系相比，抑制作用在减弱。从第3天开始降解菌开始促进栅藻生长，此后促进作用越来越明显。第6天、第7天时，虽然在4 mg/L相互作用体系中栅藻生长仍受到抑制，但其生长状况明显比0 mg/L E2的单独作用系统好。此外，实验还发现藻菌相互作用去除E2时，培养液的颜色明显比栅藻单独作用去除E2时的深，说明栅藻在共生系统中生长得更好。有报道指出藻菌共培养时菌类可促进微藻生长，如小球藻（Chlorella vulgaris）和固氮菌（Azospirillumbrasilense）共培养时固氮菌可产生促进微藻生长的激素（MGPB）^〔11〕；Synechocystic PCC6803和Pseudomonas共培养可将微藻的生物量提高8倍^〔12〕。但值得注意的是，少有应用雌激素降解菌与藻类去除雌激素的报道。

雌激素降解菌和栅藻相互作用去除E2雌激素时，栅藻对雌激素降解菌生长的影响如图3所示。

由图3可见，E2对降解菌的生长有抑制作用，E2质量浓度越高，抑制越明显。但在栅藻存在下，这种抑制作用被弱化。E2质量浓度为2、4 mg/L，相互作用时雌激素降解菌的生长状况比其单独作用时的好，甚至在4 mg/L相互作用体系中，降解菌的生长比2 mg/L单独作用系统中生长得更好。说明藻菌共培养有利于降解菌应对不利环境，在藻菌体系中，栅藻能够促进降解菌的生长。研究表明，藻菌共生体系中藻类为细菌的存活提供养分和溶氧，并分担环境压力^〔13〕。

考察了藻菌相互作用对E2的去除效果，如图4所示。

图4表明，藻菌相互作用对E2有更好的去除效果。在实验周期内，E2几乎不发生自然降解。低浓度E2条件下，单独作用和相互作用对雌激素的去除率都达到98%，藻菌相互作用对E2去除影响不明显。原因可能是低浓度时E2对栅藻和雌激素降解菌的生长抑制不明显，栅藻和雌激素降解菌单独作用就可以将E2去除至无法利用的浓度。在1~4 mg/L的质量浓度下，相互作用系统可明显促进去除雌激素，E2质量浓度越高，促进效果越明显。相互作用系统中，栅藻和雌激素降解菌是一种共生关系，可以分担环境压力，减弱E2对其抑制作用。不仅如此，栅藻生长为细菌提供氧气和营养物质；细菌的生长可以为栅藻提供二氧化碳和生长因子^〔14〕。

（1）用污水处理池水样分离纯化出无菌栅藻和雌激素降解菌嗜麦芽窄食单胞菌。正常环境下，栅藻与嗜麦芽窄单胞菌共培养存在共生关系，嗜麦芽窄食单胞菌和栅藻可促进彼此生长；在胁迫环境下可以分担环境压力，使彼此生存状况得到改善。

（2）在实验条件下（E2为0.5、1、2、4 mg/L），尽管E2在一定程度上抑制了栅藻和细菌的生长，但栅藻和嗜麦芽窄食单胞菌对E2有较好的去除效果。其相互作用不仅可以减弱雌激素对它们生长的抑制，还可以增强去除效果。在实验浓度范围内，藻菌相互作用对E2的去除率提高了10%~12%。

（3）通过藻菌共生去除雌激素是解决雌激素污染的一种可行新思路。传统方法或净化污水或去除雌激素，没有将其结合起来。从生长状况、去除效果以及其各自特点来看，将藻菌应用到污水处理中可以达到一举多得的效果。在污水处理中，藻类可脱氮除磷、降解有机物、吸收重金属离子、对水进行净化，同时减少了不利雌激素降解菌生长的因素，并提供氧气。一定程度上解决了应用时降解菌难以存活、污水处理中污泥更新等问题，并去除雌激素。