温室气体的排放对全球变暖和极端天气的出现具有重要影响。N₂O的化学性质稳定，在大气中的存留时间可达100~150 a，且其增温潜势是CO₂的298倍。污水生物脱氮过程是重要的N₂O排放源，其释放因子为0.01%~6.8%^〔1〕，占生活污水处理过程中温室气体总排放的50%以上^〔2〕。因此研究污水处理过程中N₂O的控制和释放具有重要的意义。

缺氧条件下，异养反硝化菌能够以硝酸盐氮作为电子受体，以碳源作为电子供体，最终转化为N₂。反硝化过程是一个涉及多种酶〔硝酸盐还原酶（NaR）、亚硝酸盐还原酶（NiR）、一氧化氮还原酶（NoR）、氧化亚氮还原酶（N₂OR）〕在内的复杂生化反应，通常伴随有NO₂^-和N₂O等副产物的产生^〔3〕。其中，N₂O的还原是由N₂OR接受碳源氧化释放的电子并将N₂O还原为N₂的过程。N₂O的还原与N₂OR的活性和有机物提供电子的速率密切相关^〔4〕。我国现行污水处理厂普遍存在进水COD/N较低的情况，往往需要在反硝化阶段向系统内加入外源性碳源，以提供反硝化所需电子。因此，选择廉价高效的反硝化碳源并减少反硝化过程中的N₂O产生，对生物脱氮过程具有重要意义。

本研究以乙酸钠、乙醇、甲醇为电子供体，以NO₃^-作为电子受体，考察了不同负荷条件下反硝化过程中NO₂^-和N₂O的积累特性，为反硝化过程中外加碳源的对比选择及减少N₂O的积累提供参考。

批次试验均在有机玻璃制成的SBR反应器内进行，反应器有效容积为3 L，底部设有磁力搅拌器，从而保证反硝化过程泥水混合均匀。控制反硝化过程温度为（25±1）℃。试验污泥取自某大学中试反应器反硝化结束后污泥，曝气12 h后，用去离子水清洗沉淀浓缩后待用。试验用水取自中试反应器反硝化结束后出水，出水中NH⁴⁺、NO₂^-、NO₃^-质量浓度均在1 mg/L以下。反应过程中未对pH进行调节，pH为7.0~7.8，DO < 0.05 mg/L。

采用3个SBR反应器并列运行。反硝化过程中，控制反应器内MLSS为2 800 mg/L左右。反应器内同时加入30 mg/L的NO₃^--N作为电子受体，此后分别加入乙酸钠、乙醇、甲醇作为反硝化碳源，分别标记为SBR1、SBR2、SBR3。为保证反硝化过程碳源充足，反应器内初始碳氮比（C/N）控制在5:1左右，整个反应过程持续240 min。

3个SBR反应器内分别投加约100 mg/L的NO₃^--N作为电子受体，此后分别投加乙酸钠、乙醇、甲醇作为电子供体，控制反应器内初始C/N为5:1，整个反应过程持续420 min，其他条件同1.2.1。

3个SBR反应器内同时投加30 mg/L的NO₂^--N作为电子受体，分别以乙酸钠、乙醇、甲醇为电子供体，控制反应器内C/N为5:1，其他条件同1.2.1。

以高纯N₂O对纯净水曝气5 min后制成N₂O母液，试验开始前，向3个SBR反应器内分别加入乙酸钠、乙醇、甲醇作为反硝化碳源，并同时向3个SBR反应器内加入等量的N₂O母液，控制系统内初始N₂O-N质量浓度约为20 mg/L左右，瞬时计时并在线测定，反应时间控制在30 min，其他条件同1.2.1。

试验开始前30 min内，每隔15 min取混合液20 mL，此后，每隔30 min取混合液测定各指标。以德国WTW公司Multi340i型便携式多功能测定仪在线测定系统DO和pH。试验中，COD、NH₄⁺-N、NO₂^--N、NO₃^--N和MLSS均采用标准方法分析^〔5〕，采用丹麦Unisense公司Picoammeter PA₂000型N₂O在线检测装置（检测下限为0.01 μmol/L）测定反应过程中N₂O的变化过程^〔4〕。

乙酸钠、乙醇、甲醇作为反硝化碳源时，系统NO₃^-还原、NO₂^-、N₂O积累和COD降解过程见图1。

由图1可知，3种碳源均能在120 min内完成反硝化过程，反硝化速率依次为R_乙酸钠>R_乙醇≈R_甲醇，其碳源消耗速率也遵循R_乙酸钠>R_乙醇≈R_甲醇。乙酸钠是最容易被生物利用的反硝化碳源；甲醇和乙醇的生物利用速率差别不大。各碳源作为电子受体过程中，均出现了不同程度的亚硝积累量。3种碳源中，乙酸钠利用速率最高，达到最大NO₂^-积累的时间最短，积累量最大，为6.2 mg/L。乙酸钠作为碳源，反应初始阶段，NO₃^-的还原速率最大，在电子供体充足的前提下，更有利于NaR活性增加，抑制NiR的活性，从而导致NO₂^-的积累^〔3〕。反硝化末期，乙酸钠利用速率不变，其提供电子的速率不变，而NO₃^-浓度的降低则导致了其利用电子的速率降低，因此，部分电子可以分配到NiR，NO₃^-和NO₂^-能够同时被还原。甲醇作为反硝化电子供体时，其提供电子的速率较低，该电子仅能用来满足NO₃^-的还原，因此，当NO₃^-还原结束后，才进行NO₂^-的还原。

由图1（b）还可知，无论何种碳源，反硝化初期均出现了大量N₂O的积累。反硝化速率越大，N₂O峰值出现的时间愈早，但是，出现的N₂O能够迅速被还原至N₂。15 min后，系统内无N₂O的积累。整个反硝化过程中，N₂O-N积累量最大为0.48 mg/L。N₂O是异养菌的缺氧反硝化过程中间产物，正常情况下，N₂O的还原速率高于NO₃^-和NO₂^-的还原速率，系统内不会出现N₂O的积累^〔6-7〕。J. Letey等^〔8〕研究指出，缺氧条件下，N₂OR的合成滞后于NaR，反硝化初始阶段N₂OR的缺乏，导致出现不同程度的N₂O积累。当N₂OR合成后，碳源氧化过程所提供的电子能够迅速流向N₂OR，初期积累的N₂O氧化亚氮迅速被还原，反硝化过程中，保证良好的缺氧条件并提供充足的碳源，反硝化阶段能够将滞留在系统内的N₂O还原至N₂，不会导致N₂O的积累^{〔6, 9〕}。

高NO₃^-负荷下3种碳源作为电子供体，系统反硝化过程及N₂O积累情况见图2。

由图2可知，NO₃^-负荷提高，以甲醇作为电子供体时，其反硝化速率和COD的降解速率均明显降低，且在反硝化反应的初期出现了反应滞后现象。至反应结束时（420 min），系统内仍残留有45.2 mg/L的NO₃^--N未被还原。保证碳源充足的情况下，反硝化速率与NO₃^-浓度呈零级反应，即反硝化速率与硝酸盐的浓度无关，且若以挥发性脂肪酸（VFAs）作为反硝化碳源，其速率要远大于醇类^〔10〕。以乙酸钠和乙醇作为反硝化碳源时，反应初期即出现NO₃^-的反硝化过程，表明乙酸钠和乙醇投加后能够很快被微生物所利用；其中，乙酸钠是最易被生物利用的碳源，而乙醇是本研究母反应器一直投加的反硝化碳源，微生物无需对其适应，因此，均未表现出反硝化速率降低的现象。高浓度甲醇投加后，系统内异养反硝化菌需要较长时间去适应，从而导致其反硝化速率和碳源利用速率均有所降低。与低负荷反硝化过程相比较，3种碳源高负荷反硝化过程中NO₂^--N的积累量均明显增加，分别达到23.8、26.1、18.1 mg/L，这也表明即使在高C/N下，NaR和NiR之间仍存在电子竞争机制，从而导致NO₂^--N的大量积累^〔3〕。因此，NO₂^--N积累的根本原因是2种还原酶之间的电子竞争能力存在差异^〔11〕。

3种电子供体反硝化过程中均出现了N₂O的积累，且积累量均大于低负荷条件下反硝化过程。乙酸钠作为电子供体，与低负荷反硝化过程类似，反硝化初始阶段，系统内N₂O-N的积累量迅速增加，峰值达到2.08 mg/L，且在15 min完成了积累和还原过程，此后，再无N₂O积累；而甲醇作为电子供体时，其N₂O-N积累在反硝化开始后的60 min达到1.25 mg/L，此后逐渐下降，至反应结束时，系统内仍有0.18 mg/L N₂O-N未被还原。初始阶段N₂O的积累主要源于NaR和N₂OR之间合成速率的差异，且高负荷条件下，NO₃^-浓度的增加，促进了其获得电子的能力，导致N₂O积累量大于低负荷反硝化过程。Y. T. Pan等^〔12〕的研究表明，不同电子受体之间电子竞争过程是反硝化阶段N₂O积累的主要原因。微生物整个代谢过程中，有机物的氧化和氮氧化物的还原是相互关联的耦合反应。碳源的氧化过程提供电子，而氮氧化物的还原则受到各种反硝化酶之间的相互约束，分步进行的反硝化过程中各还原酶（NaR、NiR和N₂OR）均要接受碳源氧化所产生的电子，当有机物氧化过程所提供电子速率无法满足各种还原酶同时获得电子时，将会导致不同氮氧化物还原酶之间出现电子竞争，其中，NaR获得电子能力强，NO₃^-优先被还原，即出现反硝化过程中间产物NO₂^-和N₂O的积累。本研究中，乙酸钠作为电子供体时，其提供电子的速率较大，在N₂OR合成后，所提供的电子在NaR和N₂OR之间分配，保证反硝化初始阶段积累的N₂O迅速被还原至N₂，而甲醇作为电子供体时，其氧化过程存在滞后期〔图2（b）〕，甲醇本身具有的毒性也使得微生物对其利用速率降低，提供电子速率降低，且该部分电子主要用来还原NO₃^-，导致甲醇反硝化过程中NO₂^-和N₂O的长时间积累。而反硝化后期，甲醇浓度渐低，微生物逐渐适应，对甲醇的利用速率略有增加，流向N₂OR的电子增加，N₂O积累量逐渐减少。研究也表明，反硝化过程中对N₂O还原起到抑制作用的是HNO₂，而非NO₂^-〔13〕。本研究中，保证严格的缺氧条件和充足的碳源，并没有出现NO₂^--N对N₂O还原的抑制作用，一方面，是因为反应中积累的NO₂^-浓度较低（< 25 mg/L），且反硝化提供碱度，系统pH逐渐增加，防止了高浓度FNA的生成；另一方面，良好的缺氧条件也保证了反硝化菌以氮氧化物作为电子受体，这也与Y. T. Pan等的研究结果一致^〔7〕。

不同电子供体下，NO₂^-和N₂O的还原过程以及N₂O单独作为电子受体时的还原过程见图3。

由图3（a）可知，与NO₃^-还原类似，NO₂^-还原过程的初始阶段，分别出现了1.62、1.36、1.48 mg/L N₂O-N积累，大于NO₃^-反硝化过程N₂O积累量，这表明在NO₂^-的还原过程中，同样存在N₂OR合成滞后于NiR的现象，除此之外，反硝化初始阶段高浓度的NO₂^-（约30 mg/L）可能对N₂OR具有一定的毒性，使得产生的N₂O无法迅速被还原至N₂，从而导致其N₂O积累量大于NO₃^-还原过程。10 min后，NO₂^-反硝化过程中无N₂O的积累，表明当N₂OR合成后，其获得电子的能力并没有受到NO₂^-的影响。

由图3（b）可知，N₂O单独作为电子受体时，3种碳源反硝化过程并没有明显差异，加入的N₂O均能在3 min内被还原至N₂。

不同碳源反硝化过程中各氮氧化物的还原及有机物氧化速率见表1。

由表1可知，反硝化过程中，当分别以NO₃^-、NO₂^-和N₂O作为电子受体时，R_氧化亚氮>>R_亚硝态氮>R_硝态氮。然而，不同碳源作为电子供体进行NO₃^-还原时，系统内均会出现不同程度的NO₂^-积累，且NO₂^-积累量随负荷的增加而增加。其原因可能是：NO₃^-还原过程中，NaR和NiR之间存在电子竞争关系，当电子提供能力一定时，电子流向NiR的速度较低或NiR的Ks〔酶（E）和底物（S）所形成中间产物（ES）的解离平衡常数〕较大，这就导致来自脱氢酶的电子优先流向NaR，即使NaR和NiR都合成且充分表达，系统内仍会出现NO₂^-的积累^〔14〕。反硝化过程初始阶段N₂O的积累，则归因于反硝化过程中，N₂OR的合成速率要小于NaR和NiR。根据反硝化半反应方程式，N₂O还原比NO₃^-还原释放出更多的自由能，当N₂OR合成并完全表达后，碳源氧化过程释放的电子能迅速流向N₂OR，从而导致积累的N₂O迅速被还原^〔15〕。

高负荷条件下，以甲醇作为反硝化碳源，系统内N₂O积累至最大后逐渐减少，反应结束时，仍残留有0.15 mg/L N₂O-N。碳源充足时，电子供给速率是由碳源的吸收、氧化和电子传递过程所决定的，微生物利用有机物的速率有限，有机物浓度增加，并没有提高其电子供给速率，而NO₃^-浓度的增加，增强了其获得电子的能力，从而抑制了NiR和N₂OR活性。高甲醇负荷下，微生物的活性受到抑制，COD降解速率降低，其提供电子的速率降低，四步反硝化过程通过电子竞争互相制约，而其中N₂OR受到外界因素（pH、DO、电子供体和有毒物质等^〔16〕）的影响较大，从而导致了甲醇系统反硝化过程中较长时间的N₂O积累。当反应系统总存在多种电子受体时，微生物并不能通过提高有机物的氧化速率来保证所有电子受体及时被还原，从而导致在各电子受体还原酶之间出现了电子竞争现象^〔5〕。以易生物降解有机物作为反硝化电子供体，提高反硝化电子提供速率，能够有效降低系统反硝化过程中N₂O的积累。

（1）3种电子受体的反硝化过程中，其反硝化速率和碳源利用率依次为乙酸钠>乙醇>甲醇。以乙酸钠和乙醇作为电子供体时，负荷的变化对反硝化速率无影响；以甲醇做为电子供体时，高负荷下高浓度甲醇对微生物活性具有抑制作用，系统碳源利用率和反硝化速率明显降低。

（2）低负荷反硝化过程中，仅有少量NO₂^-和N₂O积累，3种碳源反硝化过程中N₂O均在15 min内完成积累和还原现象；高负荷条件下，NO₂^-和N₂O积累量明显增加，NO₃^-对NO₂^-还原具有抑制作用，乙酸钠和乙醇作为电子供体，N₂O短时间内完成积累和还原现象；高浓度甲醇对微生物有一定毒性，其电子提供速率降低，反硝化过程中始终存在N₂O的积累。

（3）N₂OR合成速率较低导致反硝化初始阶段N₂O的积累；N₂OR合成后，反硝化电子迅速流向N₂O，完成其还原过程。多种电子受体之间的电子竞争是导致反硝化系统NO₂^-和N₂O积累的主要原因。以易生物降解有机物作为电子供体，提高其提供电子速率，能有效降低系统N₂O积累并防止其在后续好氧阶段的释放。