苄嘧磺隆（BSM）是典型的选择性内吸传导型磺酰脲类除草剂，常施用于水稻田用来防除阔叶杂草^〔1〕，是我国水稻田中使用面广、时间长、量大的一种除草剂。其发挥除草作用的机制是通过杂草的根、叶进入到体内进而作用于杂草的乙酰乳酸合酶（ALS），阻碍生物合成支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸），使细胞停留在G1期和G2期，最终导致杂草死亡^〔2-3〕。尽管BSM在环境中的半衰期短，对哺乳类动物低毒，但长期使用后，其对环境微生物的慢性毒性不可小觑。而且，不当施用会引发残留药害，全国多处已经发生了BSM造成的麦田药害减产事件^〔4〕。所以，对环境中的BSM进行去除是当前亟待解决的环境问题之一。

应用微生物降解去除环境中的BSM是一种经济、环境友好型的处理方法。已有的关于微生物降解BSM的报道主要集中在好氧微生物降解或者筛选具有降解BSM能力的微生物上^〔5-6〕。BSM在我国主要应用于水稻田中杂草的控制和去除，水稻田中残存的BSM，其存在环境更接近于厌氧环境，但目前尚无关于BSM在厌氧条件下降解的报道。此外，尽管分离得到某株能够降解BSM的纯菌具有一定的科研价值，但是大多数微生物是以微生物聚集体的形式出现在自然环境^〔7〕和人工反应器中的^〔8〕，所以研究富集培养系对BSM的降解具有更大的现实意义。

高效液相色谱1525（Waters，美国），气相色谱仪，恒温培养箱，PCR仪，厌氧瓶；厌氧颗粒污泥取自青岛某废水处理工程的上流式厌氧污泥反应床，农药污泥取自青岛某农药厂废水处理的生化池。Widdle培养基，BSM原药（纯度97.2%），乙腈（色谱纯），乙酸（色谱纯），磷酸盐缓冲液，CWBIO的土壤微生物基因组提取试剂盒。

取农药污泥和厌氧颗粒污泥进行富集，将原泥置于4 ℃冰箱中保存菌种。配制Widdle培养基，分装至50 mL厌氧瓶中，用氮气和二氧化碳混合气（体积比20:80）曝气3 min后压盖密封，在121 ℃高温高压灭菌锅中灭菌20 min后，待培养基恢复至室温加入过0.22 μm滤膜的还原剂（Na₂S，溶液最终质量浓度为0.3 g/L）。将菌种打碎后用磷酸盐缓冲液清洗、离心3次后调节pH在7.5~8.0范围内，混匀作为母液。将菌液和BSM溶液经注射器注射进入厌氧瓶中，放入37 ℃恒温箱中黑暗静置培养，待甲烷含量达到一定浓度后对其进行传代培养。

取50 mL厌氧发酵瓶，加入10 mL Widdle培养基，灭菌后向其中加入等体积的农药污泥和厌氧颗粒污泥的稳定培养系，再加入BSM溶液，使其最终质量浓度在20 mg/L左右。放置在37 ℃恒温箱中黑暗静置培养。每隔5 d取样检测生成的甲烷量（气相色谱法）和BSM的含量。

按1.3进行实验，改变BSM质量浓度分别为20、40、80 mg/L。

按1.3进行实验，改变恒温箱温度分别为25、30、37℃。

当复合菌系接种传代至第10代时，分别取20 mL菌液，提取DNA，采用CWBIO的土壤微生物基因组提取试剂盒，按照试剂盒说明书完成提取工作。使用Qubit 2.0荧光剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）和0.8%琼脂糖凝胶检测DNA质量。

PCR利用金唯智的MetaVxTM Library Preparation kit完成目标区域的扩增工作，用特异性引物对16S rDNA的V3、V4、V5区进行PCR扩增，用于V3、V4区扩增的引物序列为：上游引物5’-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3’，下游引物为（5’-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3’），V4、V5区的扩增引物序列为上游“GTGYCAGCMGCCGCGGTAA”下游为“CTTGTGCGGKC CCCCGYCAATTC”，引物序列中含有6碱基标签序列（index），每个样品加入的标签序列是唯一，以便完成后续Iiiumina Hiseq测序数据的分配。

文库构建完成后用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）对文库质量进行检测，再用Qubit和qPCR（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA）对文库进行定量。合格的DNA文库加入Illumina公司MiSeq测序仪（Illumina，San Diego，CA，USA）进行测序，测序仪单次读长为300×2 bp。对测序结果原始图像数据利用软件CASAVA（v1.8.2）进行图像碱基识别且初步质量分析，得到测序数据。苏州金唯智生物科技有限公司利用Qiime平台完成了测序数据的分析工作。

微生物因其种类丰富、分布广泛、适应性强和代谢途径多样的特点在农药污染治理方面显示出巨大优势。对可降解农药的微生物进行分离、筛选和鉴定是研究生物修复农药污染环境中的一项基础工作。有关BSM的好氧微生物降解已有研究，而关于其在淹水稻田的厌氧环境下微生物降解鲜有报道。T. Brusa等^〔9〕采用微生物混合培养的方法研究环境中BSM的降解，同时比较微生物生长介质对降解活性的影响，结果证实降解过程中有产甲烷细菌的存在，该研究为本实验的进行提供了理论支持。

按1.3对厌氧微生物降解BSM的能力以及产甲烷的情况进行了比较，结果见图1。

从图1可以看出两种复合菌系对于BSM均有一定的降解效果，BSM浓度在第5天—第10天之间有明显降低，这可能与厌氧菌的生长周期在8 d左右有关。对比两种复合菌系，在25 d内，农药污泥稳定培养系的降解率为35.4%，厌氧颗粒污泥稳定培养系的降解率为51.0%，厌氧颗粒污泥稳定培养系在该条件下具有更好的降解效果。

比较两种复合菌系的产甲烷情况，可以看出，农药污泥稳定培养系的产甲烷量要明显高于厌氧颗粒污泥稳定培养系，而从降解效果上来看，在该条件下厌氧颗粒污泥稳定培养系的降解效果要更高一些，这说明稳定培养系对BSM的降解与体系的产甲烷量并无直接的联系。

按1.4.1进行了BSM浓度对降解特性的影响实验，结果见图2。

由图2可以看出，在不同初始浓度的BSM条件下，两种体系对BSM均有一定程度的降解。在BSM的初始质量浓度为40 mg/L的条件下，农药污泥稳定培养系的降解率为39.7%，厌氧颗粒污泥稳定培养系的降解率为41.4%；BSM初始质量浓度提高到80 mg/L时，农药污泥稳定培养系对BSM的降解率达到54.0%，厌氧颗粒污泥稳定培养系对BSM的降解率达到39.8%。可以看出，随着BSM浓度的增加，两种体系的降解率表现不同：农药污泥稳定培养系的降解率在逐步增加，而厌氧颗粒污泥稳定培养系的降解率则递减。

按1.4.1进行了温度对降解特性的影响实验，结果表明，在3组温度（25、30、37 ℃）下BSM均有降解。其中25 ℃下，农药污泥稳定培养系的降解率为24.5%，厌氧颗粒污泥稳定培养系的降解率为25.5%；30 ℃下，农药污泥稳定培养系的降解率达到17.1%，厌氧颗粒污泥稳定培养系的降解率达到30.1%；35 ℃条件下，农药污泥稳定培养系对BSM的降解率达到35.4%，厌氧颗粒污泥稳定培养系的降解率达到了51.0%。这表明温度升高有助于厌氧颗粒污泥稳定培养系对于BSM的降解，而且在35 ℃条件下，BSM浓度在第5天—第10天有显著的下降，而在25、30 ℃条件下，显著的降解发生在第20天—第25天。这可能由于较低的温度不适合厌氧微生物的生长导致。

从测序的样本OTU维恩图来看，厌氧颗粒污泥稳定培养系的OTU数目为8 849，农药污泥稳定培养系的OTU数目为8 346，其中共有的OTU数目为5 552。根据DNA测序结果，得到了两种稳定培养系的主要门分类和主要属分类，分别见表1、表2。

对于厌氧颗粒污泥稳定培养系来说，其占据优势菌群的门（按DNA的质量分数计）为Spiroch-aetes（23.18%）、Bacteroidetes（19.96%）、Synergistetes（10.58%）、Euryarchaeota（7.43%）。农药污泥稳定培养系中，优势菌群的门与厌氧颗粒污泥稳定培养系相同，含量有所不同：Spirochaetes（13.28%）、Bacter-oidetes（15.1%）、Euryarchaeota（17.6%）、Synergistetes（8.97%）。两者在Spirochaetes和Euryarchaeota门上相差较大。

按DNA的质量分数计，厌氧颗粒污泥稳定培养系中Methanomethylovorans属所占比例为6.8%，而农药污泥稳定培养系中其比例要比厌氧颗粒污泥稳定培养系高的多，为17.55%；两种稳定培养系中Thermanaerovibrio属的含量接近，在厌氧颗粒污泥稳定培养系的比例为8.05%，在农药污泥稳定培养系中的比例为7.04%；同样地，相对含量较高的属Blvii28_wastewater-sludge_group、Proteiniphilum、S50_wastewater-sludge_group在两种稳定培养系中的含量基本相同，对于Bacillus属来说，农药污泥稳定培养系的含量要高于厌氧颗粒污泥稳定培养系，前者含量为2.92%，后者为1.5%。属Marinobacter和Salegentibacter在厌氧颗粒污泥稳定培养系中未出现，在农药污泥稳定培养系中则有少量的含量。

Bacillus属属于厚壁菌门（Firmicutes）。该属的菌株广泛存在于淡水、卤水、土壤、植物、动物及空气等多种不同的生态环境条件中，属内的菌株数量可达到289种^〔10〕。大多数的Bacillus属内菌株为革兰氏阳性菌，短杆状，可产芽孢，营好氧或兼性厌氧生长。

关靓^〔11〕在施用了氯嘧磺隆的土壤中分离驯化得到1株高效降解氯嘧磺隆的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），该菌株的最适生长温度为35~37 ℃，pH为6~7。李丽^〔12〕研究了巨大芽孢杆菌（Bacillus megateri-um E-1）的粗酶液对于10 mg/L氯嘧磺隆的降解率为52.7%。Z. H. Kang等^〔13〕报道了降解菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）粗酶液对烟嘧磺隆有降解效果，在35 ℃、pH 9.0条件下，对5 mg/L的烟嘧磺隆的降解率可达66%。林晓燕^〔14〕分离得到的降解菌属也属于芽孢杆菌（Bacillus），其对BSM有很好的降解效果。根据上述已有的报道和测序结果进行推断，两种降解菌系对BSM有直接降解作用的可能有Bacillus属。

本研究应用两组稳定培养系对环境中的BSM进行去除，发现两组稳定培养系可以在厌氧条件下降解BSM，而且厌氧颗粒污泥稳定培养系的降解效果略好于农药污泥稳定培养系；两组厌氧培养系在不同条件下去除BSM的效果存在差异：随着BSM浓度的增加，农药污泥稳定培养系的降解率逐步增加，而厌氧颗粒污泥稳定培养系的降解率则递减，温度的升高有利于提高两组厌氧培养系的降解率；利用分子生物学手段解析了两组具有降解BSM能力的厌氧微生物菌落的结构，结果表明：两种稳定培养系中占据优势菌群的门均为Spirochaetes、Bacteroide-tes、Synergistetes、Euryarchaeota。