近年来国内地表水和地下水受苯酚及硝态氮污染较为严重，其中苯酚具有高毒性及潜在的致癌性，对动植物及人类健康均有较大危害^〔1〕。目前，降解水中苯酚的方法主要有化学法（如高级氧化法^〔2〕、超临界水氧化法）、物理法（如混凝法、微波法、超声波法、吸附法、电催化、光催化及二氧化钛催化）和生物降解法，其中生物降解法因具有处理成本低、二次污染小、处理效率高的优点，在含酚废水处理中得到广泛应用。

同传统硝化脱氮工艺相比，异养硝化-好氧反硝化具有比较突出的优点：（1）异养硝化-好氧反硝化菌能同步进行硝化、反硝化作用，即可在同一反应器内进行反应，节省了占地面积及成本^〔3〕；（2）在反硝化过程中产生的碱度能中和硝化过程中产生的酸度，从而使得系统pH保持相对稳定^〔4-5〕；（3）水中有机物可以作为碳源的特性使得好氧反硝化菌能在异养硝化时同步去除水中高浓度有机物，克服了传统硝化池不耐有机负荷的缺点^〔6〕。

目前，对好氧反硝化处理硝态氮时以苯酚为底物的研究相对较少。Jianhang Zhu等^〔7〕使用长期驯化的污泥在厌氧条件下处理含有苯酚和硝态氮的合成废水，结果表明，苯酚和硝态氮降解率分别为93.3%和98.0%。张小妹等^〔8〕在厌氧条件下进行了全程反硝化降解苯酚和硝态氮的研究，结果表明，苯酚和硝态氮降解率分别为83%、99%；PCR-DGGE及切胶测序显示，菌群以变形菌纲及拟杆菌纲为主。Qilong Ge等^〔9〕从焦化废水中分离出一株能够降解苯酚、异养硝化和好氧反硝化的菌株Diaphorobacter sp. PD-7，用其处理含有苯酚和硝态氮的水体，结果表明，当苯酚初始质量浓度为1 400 mg/L时，65 h的苯酚降解率为100%，硝态氮降解率达91%。

本实验研究了菌株Pseudomonas sp. BN5^〔10〕在硝态氮为唯一氮源、苯酚为唯一碳源时的好氧反硝化特性。采用单因素法对反应条件进行了优化，使用Haldane方程对细胞生长过程进行了拟合，并通过好氧反硝化关键酶酶活及氮平衡分析研究了异养硝化、好氧反硝化降解特性。该项研究可为好氧反硝化菌的实际应用提供参考。

本实验所用假单胞菌Pseudomonas sp. BN5分离自活性污泥^〔10〕。

LB培养基^〔11〕：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH=7。

好氧反硝化（DM）培养基^〔12〕：苯酚按需加入，NaNO₃ 0.25 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，CaCl₂ 0.02 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.005 g/L，1 mL微量元素溶液，pH=7。

微量元素溶液：CuSO₄·5H₂O 0.08 g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.22 g/L，Fe₂（SO₄）3·H₂O 0.01 g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 1.26 g/L，MnSO₄·4H₂O 2.03 g/L，H₃BO₃ 2.86 g/L，MnSO₄· H₂O 0.01 g/L，pH=7。

以上培养基及所有实验器具于121 ℃高压蒸汽锅灭菌20 min，固体培养基另加16 g/L琼脂粉。

取200 mL液态LB培养基于250 mL锥形瓶中，将甘油冷冻保藏（-80 ℃）的菌种BN5常温解冻，接种至培养基中，然后置于摇床恒温振荡培养（30 ℃，130 r/min）至指数生长后期。取培养液离心（6 000 r/min，4 ℃，10 min）后，用DDH₂O清洗2次，备用。

采用单因素法研究好氧条件下pH、摇床转速对菌株BN5好氧反硝化降解苯酚效果的影响，以确定最佳培养条件。在苯酚初始质量浓度为420 mg/L的DM培养基中接种5%的BN5，设置培养温度30 ℃，培养时间72 h。

在确定的最优培养条件下，以5%的接种量接种BN5到苯酚初始质量浓度为420 mg/L的DM培养基中，于摇床内培养72 h。每隔6 h检测苯酚、NO₃^--N、NO₂^--N含量及细胞浓度。

在最佳培养条件下，采用Haldane方程进行动力学研究。选取苯酚质量浓度梯度：0~200 mg/L之间为每20 mg/L一个浓度梯度；200~600 mg/L之间为每100 mg/L一个浓度梯度。以5%的接种量接种BN5，在摇床中恒温培养72 h。每隔6 h检测各锥形瓶内培养基的OD₆₀₀值及硝态氮含量。

（1）粗酶液提取^〔6〕。以5%的接种量将菌株BN5接种于DM培养基中，在最佳条件下于摇床内培养30 h后，离心20 min（10 000 r/min，4 ℃）。取沉淀菌体，用磷酸缓冲液冲洗3次（0.01 mol/L，pH=7.4），使菌体细胞重新悬浮，再用超声波细胞粉碎机（JY92- IIN）破碎细胞。离心20 min（12 000 r/min，4 ℃）后，取上清液，即为粗酶液，低温保存待用。

（2）酶活分析^〔13〕。硝酸还原酶（NAR）和亚硝酸还原酶（NIR）的测定体系（10 mL）：10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.4），0.2 mmol/L NADH，800 μL粗酶液。分别加入10 μmol/L硝酸钠、10 μmol/L亚硝酸钠进行反应。NAR、NIR活性由反应前后硝酸钠、亚硝酸钠消耗量得出。总蛋白质浓度测定采用Bradford法^〔14〕。一个酶活力单位（U）定义为1 min催化1 μmol底物所需的酶量，酶比活力（U/mg）定义为每毫克蛋白质所含有的酶活力单位数。

在最佳条件下培养菌株BN5 72 h，离心（6 000 r/min，10 min，4 ℃）后，取上清液测定TN、NH₄⁺-N、NO₃^--N、NO₂^--N；取沉淀部分测定胞内氮，进行氮平衡分析。

参照参考文献〔15〕进行菌液浓度的测定；苯酚浓度采用液相色谱（P1201，大连依利特）仪进行测定；NO₃^--N采用麝香草酚分光光度法测定；NO₂^--N采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法测定；NH₄⁺-N采用纳氏试剂分光光度法测定；胞内氮采用元素分析仪（EA3000，意大利欧维特）进行测定。有机氮为TN减去NO₃^--N、NO₂^--N、NH₄⁺-N之和。数据分析采用Origin。

在摇床转速为180 r/min的条件下，考察了pH（5、6、7、8、9）对苯酚降解和硝态氮去除的影响，结果如图1所示。

由图1可知，随着pH的升高，苯酚和硝态氮降解率呈先迅速升高后逐渐下降的变化趋势，当pH=7时降解效果最佳，苯酚和硝态氮降解率分别为100%、93.31%。培养基pH偏低或偏高均会抑制菌株BN5的生长和相关酶的活性。选择pH=7为最优pH。

在pH=7的条件下，考察了摇床转速（120、140、160、180、200 r/min）对苯酚降解和硝态氮去除的影响，结果如图2所示。

菌株BN5为好氧反硝化菌，改变摇床转速可以控制培养基中溶解氧（DO）浓度。实验初期（1 h），转速分别为120、140、160、180、200 r/min时，培养液DO分别为（6.12±0.03）、（6.39±0.04）、（6.58±0.02）、（6.76± 0.02）、（6.83±0.04）mg/L。由图2可知，当转速< 180 r/min时，菌株BN5对苯酚及硝态氮的降解率随转速的增大而迅速提高。当转速为180 r/min时，苯酚和硝态氮降解率达到最大，分别为100%、93.31%。当转速＞180 r/min时，降解率则有所降低，原因可能是溶解氧不再是降解苯酚及硝态氮的限制因素，并且转速太高菌体受到剪切作用，导致活性降低。选择最优转速为180 r/min。

考察了菌株BN5对苯酚降解和硝态氮去除的特性，结果如图3所示。

由图3可知，菌株经过12 h的停滞期（0~12 h）后，进入指数生长期（12~30 h），此时是细菌生长繁殖最旺盛的时期，反硝化主要在这一阶段完成，苯酚、NO₃^--N被迅速消耗。接种30 h后进入稳定期。在指数生长期，苯酚质量浓度从401.52 mg/L降到95.36 mg/L，最大苯酚降解速率为17.01 mg/（L·h），硝态氮从39.79 mg/L降至11.23 mg/L，最大硝态氮去除速率为1.59 mg/（L·h）。在培养期末期，细胞浓度有所降低，这可能是因为培养基内营养消耗殆尽，细胞内源呼吸导致。在实验周期72 h后，硝态氮为2.76 mg/L，硝态氮降解率为93.31%；苯酚浓度为0，苯酚降解率为100%。

另外，在指数生长期有NO₂^--N积累，30 h时有最大积累，为6.58 mg/L。这可能是因为反硝化过程中产生的碱使得pH升高，抑制了相关酶的活性，使得NO₂^--N降解速率下降，而相对NO₂^--N，NO₃^--N的降解速率受抑制程度较低；随着反应的继续进行，细胞浓度上升，底物去除速率增强，积累的NO₂^--N被去除^{〔9, 16〕}。

本研究用Haldane方程描述高浓度苯酚降解动力学，方程式：

(1)

式中：

当菌株处于指数生长期时，μ为常数，即每个初始苯酚浓度S对应的μ由其指数生长期决定。对每一个浓度梯度试样中指数生长期的细胞含量和时间的半对数图做线性最小二乘拟合得到对应μ值。

将实验所得数据用Origin软件利用非线性最小二乘法进行拟合，得到细胞生长Haldane方程拟合曲线，见图4。

由图4可知，实验数据与模型预测吻合良好。方程动力学参数：μ_max=0.34 h^-1，K_S=12.88 mg/L，K_i=202.59 mg/L（R²=0.989）。由图4还可看出，菌株比生长速率在苯酚质量浓度为51.54 mg/L时达最大；继续增加苯酚浓度，由于底物抑制作用的增强，比生长速率持续减小；当苯酚质量浓度<51.54 mg/L时，比生长速率随苯酚浓度减少而迅速下降，这是由于苯酚浓度较低，导致培养基中缺乏足够的碳源供细胞生长，使得底物限制作用起主导作用。

苯酚初始浓度对细胞生长和硝态氮去除的影响如图5所示。

由图5可知，随着苯酚初始浓度的增大，细胞生长速率逐步降低，硝态氮去除耗时增长，最终细胞浓度升高。说明反应体系中底物抑制作用随苯酚浓度的增大而逐渐增强，从而使得硝态氮去除速率降低，细胞生长速率也随之减小。而充足的碳源有利于细胞生长，较高浓度的苯酚也可能会有利于细胞进行异养硝化，使得更多的碳源用于合成细胞，导致最终细胞浓度升高。

苯酚初始浓度对NAR、NIR活性影响实验结果表明，在初始苯酚质量浓度分别为420、570、720 mg/L的3个反应器内提取的粗酶液中，NAR酶活分别为0.112、0.097、0.074 U/mg，NIR酶活分别为0.105、0.086、0.057 U/mg。说明较高浓度的苯酚会抑制NAR和NIR的活性，且随浓度升高其对NIR的抑制程度也逐渐增强。

菌株BN5好氧反硝化过程中的各类氮含量如表1所示，其中锥形瓶内初始DM培养基为200 mL。NO₃^--N是唯一氮源，所以最初NO₃^--N是氮的唯一形式，故TN为8.24 mg。

可以看出，随着反应的进行，有机氮、NH₄⁺-N及NO₂^--N出现积累，胞内氮从0.41 mg增长到4.61 mg，增长量占TN去除量的54.6%。氮损失为39.4%，损失的这部分氮以含氮气体的形式被去除^〔6〕。菌株BN5在反应过程中胞内氮增加量与氮损失占初始TN的95.35%，说明菌株BN5主要通过好氧反硝化作用和细胞同化作用脱氮^{〔9, 17〕}。

（1）研究了菌株Pseudomonas sp. BN5利用NO₃^--N为电子供体，苯酚为唯一碳源进行好氧反硝化的反应特性。经单因素实验，得出最佳反应条件：pH= 7，摇床转速180 r/min。在最佳条件下接种72 h，硝态氮去除率达93.31%，平均硝化速率为0.53 mgNO₃^--N/（L·h）；苯酚降解率达100%，平均降解速率为5.83 mg苯酚/（L·h）。在30 h时有NO₂^--N最大积累，为6.58 mg/L。

（2）使用Haldane方程对菌株BN5细胞生长进行动力学分析，结果表明，曲线拟合度良好。在最佳菌株培养条件下，细胞生长动力学参数：μ_max=0.34 h^-1，K_S=12.88 mg/L，K_i=202.59 mg/L（R²=0.989）。

（3）较高的初始苯酚浓度会抑制苯酚降解，使得细胞生长速率降低，但有利于细胞异养硝化，使得最终细胞浓度相比提高。NAR及NIR酶活随苯酚浓度的升高而逐渐降低，且NIR受到的抑制程度较大。

（4）氮平衡分析表明，菌株BN5主要通过好氧反硝化作用及细胞同化作用脱氮。